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为 CRISPR 筛选创建高通量统一克隆寡核苷酸池的平台
第 2 届 CRISPR 技术国际研讨会（2018 年）上的演讲
CRISPR 系统及其相关核酸酶是通过小导向 RNA (gRNA) 靶向 DNA 切割位点的内切酶。gRNA 包含一个可变的 20 核苷酸序列，用于靶向特定的 DNA 切割位点 (crRNA)，而核酸酶结合需要一个更长的支架序列 (tracrRNA)。为了方便起见，单向导 RNA (sgRNA) 将 crRNA 和 tracrRNA 连接成一个嵌合分子。CRISPR 筛选使用载体中递送的 sgRNA 序列文库作为体内转录为 gRNA 的 DNA。通常筛选中最具挑战性的部分并非其表征，而是将寡核苷酸池克隆到诱导型启动子下的载体中。这存在两个方面的问题：第一是缺乏高质量的寡核苷酸池，其次是扩增、克隆和生长后寡核苷酸序列表达的偏差。我们在这里突出说明了 Twist Bioscience 的多重寡核苷酸池文库在整个扩增和克隆过程中保持一致性的能力。我们通过集落形成单位 (CFU) 的数量来测定克隆方法的效率，并使用新一代测序法（NGS 法）在扩增和克隆后测量序列分布和一致性。我们证实了使用更长的插入片段纠正方法特异性克隆偏倚，以提高最终克隆池中的序列一致性。
