Twist 96-Plex LP-Kit

Das Kit ist so konfiguriert, dass es bis zu 96 Proben in jeder Charge verarbeiten kann. Leere Vertiefungen in der „A“-Platte können nicht für eine spätere Charge aufbewahrt werden, sodass eine unvollständige Befüllung der Platte die Kosteneffizienz beeinträchtigen würde. 

Wenn Sie weniger als 96 Proben auf einmal verarbeiten möchten, empfehlen wir, den Rest der Platte mit Probenreplikaten zu füllen, was eine noch größere Sicherheit der Sequenzierungsergebnisse bietet.  

Das Kit ist mit Illumina-Plattformen kompatibel. Es bereitet doppelsträngige Librarys mit Illumina-Adaptern in voller Länge vor, die für die Sequenzierung von einzelnen oder gepaarten Enden bestimmt sind. Zurzeit sind die endgültigen Librarys nicht mit anderen Sequenzierungstechnologien kompatibel.

Unsere 96-Plex-Kits haben ein Verfallsdatum von einem Jahr ab dem Zeitpunkt der Herstellung. 

Ja. In diesem Fall sollte der 6-Nukleotid-Index von Illumina small RNA TruSeq i7, der die Platte identifiziert, nicht gelesen werden. Führen Sie entweder keinen Indexierungs-Read durch oder verwenden Sie die Option „--use-bases-mask“, um den 6nt-Index-Read zu ignorieren. Dies sollte zu einem einzigen Satz von FASTQs für den gesamten Sequenzierungslauf führen. Weitere Informationen finden Sie im Demux Guide.

Die TruSeq-Adaptersequenzen sollten für das Adapter-Trimming während des Illumina bcl2fastq2/bclconvert-Demultiplexing auf Plattenebene verwendet werden. Das fgbio Demux Tool ermöglicht es Ihnen, den Inline-Barcode auf R1 und die synthetischen Randomere auf Reads während der Demultiplexierung auf Probenebene zu trimmen.

Einzelne Boxen und Komponenten sind zurzeit nicht erhältlich.

Das Kit enthält zwei Primerplatten zur Verwendung während der „A“-Reaktion. Die Platte mit hohem GC-Gehalt enthält zufällige Primer, die auf > 50 % GC-Gehalt abgestimmt sind, während die Platte mit niedrigem GC-Gehalt Primer enthält, die auf < 50 % GC-Gehalt abgestimmt sind. Die Benutzer können ihren Arbeitsablauf optimieren, indem sie eine der beiden Platten verwenden oder sie im Verhältnis 1:1 für 40–60 % GC kombinieren. 

Zurzeit nicht.

Verwenden Sie die standardmäßig empfohlene Ladekonzentration für die von Ihnen verwendete Sequenzierungsplattform. Die Molarität sollte anhand der Bereichsanalyse des Hauptzielpeaks vom Agilent Bioanalyzer bestimmt werden. Verdünnen Sie auf der Grundlage dieser Quantifizierung und nicht auf der Grundlage der Modus-Peakgröße oder der Standard-Molaritätsschätzung.  

Das Demultiplexing von Twist 96-Plex-Librarys unterscheidet sich vom Standardverfahren. Die Barcodes der einzelnen Proben befinden sich in einer Zeile als Teil von R1 und nicht an der Standardposition i5. Aus diesem Grund erkennen die Illumina-Tools bcl2fastq2 und BCLconvert den Barcode der einzelnen Proben nicht und kombinieren stattdessen während des Demultiplexing alle Wells zu einer einzigen FASTQ-Datei auf Plattenebene, die auf dem einzelnen i7-Index basiert. 

Um dieses Problem zu lösen, müssen 96-Plex-Benutzer einen zweistufigen Demux-Prozess durchführen. Zunächst müssen die BCL-Dateien für jeden Zyklus in eine FASTQ-Datei auf Plattenebene umgewandelt werden, und anschließend erfolgt eine zweite Umwandlung der FASTQ-Dateien auf Plattenebene in probenspezifische FASTQ-Dateien. Wir empfehlen die Verwendung der Open-Source-Software fgbio DemuxFastqs zur Erstellung von FASTQs pro Probe. Weitere Informationen finden Sie in der Demultiplexing-Anleitung auf der Twist-Website.

The Twist 96-Plex Library Preparation Kit can be found on Twist’s eCommerce site.  In the SARS application, search for either 104951 or 104950; this will bring up the Twist 96-Plex Library Preparation Kit, 4x96 samples ($4,300) or 10x96 samples ($9,600).

Das Kit enthält alle notwendigen Reagenzien für die Vorbereitung von bis zu 960 sequenzierfähigen Librarys. Der Kunde muss jedoch übliche Laborgeräte und Reagenzien wie Pipettenspitzen, einen Magnetständer und EDTA bereitstellen. Eine vollständige Liste finden Sie im Protokoll.  

Der Kunde ist auch für die Bereitstellung von Rechenressourcen für das Demultiplexing verantwortlich. Twist bietet eine Anleitung für die Durchführung von Proben-Demultiplexing.

Wir bieten zwei Größenkonfigurationen an Kits an.

Die erste ist ausreichend für bis zu 960 Proben; das Kit enthält genügend Reaktionen für zehn 96-Well-Platten. Das Kit muss nicht auf einmal verwendet werden, es wird jedoch empfohlen, mindestens eine Platte pro Sequenzierungslauf zu verwenden.

Our newest configuration is a 4x96 configuration kit that can do 384 samples. This kit offers the same workflow and per-sample cost benefits as the 10x96 kit, but provides a lower overall price and sample volume that may be more suitable for new customers looking to try out the product or for customers with discrete projects involving less than 960 samples. 

Weitere Produktinformationen finden Sie auf der Twist-Website, einschließlich Links zum Produktblatt, Protokoll und Demultiplexing-Leitfaden. 

Ja, aber das Demultiplexing muss unabhängig voneinander erfolgen, für jeden Librarytyp einzeln. Siehe Demultiplexing-Leitfaden für spezifische Anweisungen.

Die empfohlene Eingangsmenge beträgt 50 ng, was etwa 200 ng der endgültigen Library ergeben sollte. Dieses Ergebnis hängt von den Bedingungen für die Auswahl der Beadgröße ab. Als Input wird DNA mit hohem Molekulargewicht empfohlen. Wir empfehlen, degradierte Proben, wie FFPE, mit diesem Kit zu vermeiden.

Das 96-Plex Library Prep Protokoll ist auf der Twist Website verfügbar. 

Da der Mechanismus für das Index-Hopping mit dem Adapter-Swapping verbunden ist, ist es unwahrscheinlich, dass die 96-Plex-Librarys betroffen sind, da sie einen Inline-Barcode verwenden. Darüber hinaus sollte der abschließende beadbasierte Größenauswahlschritt während der Library-Vorbereitung alle freien Adapter in der endgültigen Library minimieren.

Das Kit ist so konfiguriert, dass es bis zu 96 Proben in jeder Charge verarbeiten kann. Leere Vertiefungen in der „A“-Platte können nicht für eine spätere Charge aufbewahrt werden, sodass eine unvollständige Befüllung der Platte die Kosteneffizienz beeinträchtigen würde. 

Wenn Sie weniger als 96 Proben auf einmal verarbeiten möchten, empfehlen wir, den Rest der Platte mit Probenreplikaten zu füllen, was eine noch größere Sicherheit der Sequenzierungsergebnisse bietet.  

Das Kit ist mit Illumina-Plattformen kompatibel. Es bereitet doppelsträngige Librarys mit Illumina-Adaptern in voller Länge vor, die für die Sequenzierung von einzelnen oder gepaarten Enden bestimmt sind. Zurzeit sind die endgültigen Librarys nicht mit anderen Sequenzierungstechnologien kompatibel.

Unsere 96-Plex-Kits haben ein Verfallsdatum von einem Jahr ab dem Zeitpunkt der Herstellung. 

Ja. In diesem Fall sollte der 6-Nukleotid-Index von Illumina small RNA TruSeq i7, der die Platte identifiziert, nicht gelesen werden. Führen Sie entweder keinen Indexierungs-Read durch oder verwenden Sie die Option „--use-bases-mask“, um den 6nt-Index-Read zu ignorieren. Dies sollte zu einem einzigen Satz von FASTQs für den gesamten Sequenzierungslauf führen. Weitere Informationen finden Sie im Demux Guide.

Die TruSeq-Adaptersequenzen sollten für das Adapter-Trimming während des Illumina bcl2fastq2/bclconvert-Demultiplexing auf Plattenebene verwendet werden. Das fgbio Demux Tool ermöglicht es Ihnen, den Inline-Barcode auf R1 und die synthetischen Randomere auf Reads während der Demultiplexierung auf Probenebene zu trimmen.

Einzelne Boxen und Komponenten sind zurzeit nicht erhältlich.

Das Kit enthält zwei Primerplatten zur Verwendung während der „A“-Reaktion. Die Platte mit hohem GC-Gehalt enthält zufällige Primer, die auf > 50 % GC-Gehalt abgestimmt sind, während die Platte mit niedrigem GC-Gehalt Primer enthält, die auf < 50 % GC-Gehalt abgestimmt sind. Die Benutzer können ihren Arbeitsablauf optimieren, indem sie eine der beiden Platten verwenden oder sie im Verhältnis 1:1 für 40–60 % GC kombinieren. 

Zurzeit nicht.

Verwenden Sie die standardmäßig empfohlene Ladekonzentration für die von Ihnen verwendete Sequenzierungsplattform. Die Molarität sollte anhand der Bereichsanalyse des Hauptzielpeaks vom Agilent Bioanalyzer bestimmt werden. Verdünnen Sie auf der Grundlage dieser Quantifizierung und nicht auf der Grundlage der Modus-Peakgröße oder der Standard-Molaritätsschätzung.  

Das Demultiplexing von Twist 96-Plex-Librarys unterscheidet sich vom Standardverfahren. Die Barcodes der einzelnen Proben befinden sich in einer Zeile als Teil von R1 und nicht an der Standardposition i5. Aus diesem Grund erkennen die Illumina-Tools bcl2fastq2 und BCLconvert den Barcode der einzelnen Proben nicht und kombinieren stattdessen während des Demultiplexing alle Wells zu einer einzigen FASTQ-Datei auf Plattenebene, die auf dem einzelnen i7-Index basiert. 

Um dieses Problem zu lösen, müssen 96-Plex-Benutzer einen zweistufigen Demux-Prozess durchführen. Zunächst müssen die BCL-Dateien für jeden Zyklus in eine FASTQ-Datei auf Plattenebene umgewandelt werden, und anschließend erfolgt eine zweite Umwandlung der FASTQ-Dateien auf Plattenebene in probenspezifische FASTQ-Dateien. Wir empfehlen die Verwendung der Open-Source-Software fgbio DemuxFastqs zur Erstellung von FASTQs pro Probe. Weitere Informationen finden Sie in der Demultiplexing-Anleitung auf der Twist-Website.

The Twist 96-Plex Library Preparation Kit can be found on Twist’s eCommerce site.  In the SARS application, search for either 104951 or 104950; this will bring up the Twist 96-Plex Library Preparation Kit, 4x96 samples ($4,300) or 10x96 samples ($9,600).

Das Kit enthält alle notwendigen Reagenzien für die Vorbereitung von bis zu 960 sequenzierfähigen Librarys. Der Kunde muss jedoch übliche Laborgeräte und Reagenzien wie Pipettenspitzen, einen Magnetständer und EDTA bereitstellen. Eine vollständige Liste finden Sie im Protokoll.  

Der Kunde ist auch für die Bereitstellung von Rechenressourcen für das Demultiplexing verantwortlich. Twist bietet eine Anleitung für die Durchführung von Proben-Demultiplexing.

Wir bieten zwei Größenkonfigurationen an Kits an.

Die erste ist ausreichend für bis zu 960 Proben; das Kit enthält genügend Reaktionen für zehn 96-Well-Platten. Das Kit muss nicht auf einmal verwendet werden, es wird jedoch empfohlen, mindestens eine Platte pro Sequenzierungslauf zu verwenden.

Our newest configuration is a 4x96 configuration kit that can do 384 samples. This kit offers the same workflow and per-sample cost benefits as the 10x96 kit, but provides a lower overall price and sample volume that may be more suitable for new customers looking to try out the product or for customers with discrete projects involving less than 960 samples. 

Weitere Produktinformationen finden Sie auf der Twist-Website, einschließlich Links zum Produktblatt, Protokoll und Demultiplexing-Leitfaden. 

Ja, aber das Demultiplexing muss unabhängig voneinander erfolgen, für jeden Librarytyp einzeln. Siehe Demultiplexing-Leitfaden für spezifische Anweisungen.

Die empfohlene Eingangsmenge beträgt 50 ng, was etwa 200 ng der endgültigen Library ergeben sollte. Dieses Ergebnis hängt von den Bedingungen für die Auswahl der Beadgröße ab. Als Input wird DNA mit hohem Molekulargewicht empfohlen. Wir empfehlen, degradierte Proben, wie FFPE, mit diesem Kit zu vermeiden.

Das 96-Plex Library Prep Protokoll ist auf der Twist Website verfügbar. 

Da der Mechanismus für das Index-Hopping mit dem Adapter-Swapping verbunden ist, ist es unwahrscheinlich, dass die 96-Plex-Librarys betroffen sind, da sie einen Inline-Barcode verwenden. Darüber hinaus sollte der abschließende beadbasierte Größenauswahlschritt während der Library-Vorbereitung alle freien Adapter in der endgültigen Library minimieren.