Incorporación de vectores personalizados

El tiempo de respuesta para la incorporación es de 10 a 15 días hábiles desde el inicio de la incorporación (no desde que recibimos el vector). Asignaremos una fecha de inicio una vez que recibamos tanto la alícuota del vector como el formulario de incorporación de vectores completo.  

Encontrará información sobre los precios de la incorporación de vectores personalizados en nuestro sitio web, en su cuenta.

Si necesita ponerse en contacto con su administrador de cuentas por algún aspecto relacionado con los precios, encontrará su información de contacto en el sitio de comercio electrónico en Account (Cuenta).

El ADN del vector debe resuspenderse en amortiguador Tris-EDTA (TE) sin nucleasas, pH 8,0 o Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. No recomendamos la resuspensión en agua.

Si se descubren problemas imprevistos durante el proceso de incorporación, el servicio de atención al cliente se lo notificará de inmediato y le proporcionará una fecha de finalización revisada para la incorporación.

Los vectores Twist (secuencias y mapas) están disponibles en la página de su cuenta, dentro de la sección “Mis vectores”. 

Póngase en contacto con customersupport@twistbioscience.com.

Usamos un método de clonación patentado basado en homología para ensamblar nuestros genes clonados, de modo que los sitios de restricción no son fundamentales para la clonación y no necesita considerar el diseño de clonación de Twist al diseñar su inserción. Sin embargo, si su sitio de inserción está entre dos sitios de restricción, incluya estos como parte del esqueleto del vector para garantizar que las características estén en el marco.

Hay dos opciones para usar la clonación con enzimas de restricción.

Opción 1: incluir sitios de restricción en la inserción

Incluya todo el sitio de la enzima de restricción en cada extremo de la secuencia de inserción. Los sitios de las enzimas de restricción formarán parte de las inserciones vía simulación computacional.

Cuando pida genes, deberá incluir sitios de enzimas de restricción en las inserciones. En este escenario de incorporación de vectores personalizados, si excluye los sitios de enzimas de restricción en los genes de su pedido, los sitios de enzimas de restricción estarán completamente ausentes de su producto final.

Opción 2: incluir sitios de restricción en el vector

No incluya sitios de la enzima de restricción en la secuencia de inserción. Incluya cada sitio completo de la enzima de restricción en la casilla del vector + inserción del formulario de incorporación del vector personalizado. Los sitios de las enzimas de restricción formarán parte del vector vía simulación computacional.

Cuando pida genes, no incluya sitios de enzimas de restricción en las inserciones. En este escenario de incorporación de vectores personalizados, si incluye los sitios de enzimas de restricción en los genes de su pedido, los sitios de enzimas de restricción estarán duplicados en su producto final.

Después de ingresar su inserción en el diseñador y seleccionar su vector personalizado, descargue la secuencia de estructura final del sitio web de Twist. 

Detalles a continuación:

Al realizar el pedido:

El botón “Download sequences” (Descargar secuencias) en la página de borradores le dará detalles de la secuencia de inserción, vector y estructura final para todo el pedido.

El botón “Download construct (GenBank)” (Descargar estructura [GenBank]) en la página del editor de genes le proporcionará un archivo GenBank anotado con la secuencia de estructura final.

Después de realizar el pedido:

Vaya a “Orders & Drafts” (Pedidos y borradores) desde la página de inicio y, luego, haga clic en “open orders” (abrir pedidos). Busque el pedido de interés y se mostrará la información del pedido. Puede hacer clic en el botón “original submitted sequences” (secuencias originales enviadas), que descargará un archivo con sus secuencias finales.

Tras diseñar el sitio de inserción en la aplicación, haga clic en el enlace “Previsualizar y añadir” junto a la casilla del número para revisar el sitio de inserción en el formulario del mapa o en el formulario de la secuencia. Una vez revisado el sitio de inserción y determinado que el sitio de inserción se ha configurado correctamente, seleccione “Aprobar punto de inserción”. Los detalles del sitio de inserción aparecerán como una fila bajo los “SITIOS DE INSERCIÓN” en la parte izquierda del panel y podrá seguir editando su borrador con sitios de inserción nuevos. Sin embargo, tenga en cuenta que pueden añadirse varios sitios de inserción a cada vector personalizado. Solo puede clonarse un inserto en un vector en una sola vez.

Nota: Si desea añadir un sitio de inserción a un vector ya enviado, no necesita enviarnos una nueva alícuota de material del vector, solo póngase en contacto con el servicio de atención al cliente mediante la dirección customersupport@twistbioscience.com, ya que se debe enviar con otro formulario de envío. 

Un vector con un sitio de inserción se considera un evento de incorporación. Múltiples sitios de inserción resultarán en múltiples eventos de incorporación.

Hay una tarifa de incorporación única de 500 USD por el primer sitio de inserción y de 250 USD por cada sitio de inserción adicional en el mismo vector personalizado. 

No utilizamos la clonación basada en enzimas de restricción. No incluya nucleótidos adicionales en sus inserciones antes de la digestión de la enzima de restricción seguida de la ligadura del ADN.

Cuando realiza un pedido de un gen clonado, sintetizamos exactamente la secuencia de inserción que nos envía. Si incluye sitios de enzimas de restricción flanqueantes, también los sintetizaremos; los pares de bases adicionales no se eliminan. Las secuencias de inserción no se procesan de ninguna manera una vez que se reciben.  

Si está realizando un pedido de genes clonados utilizando un vector Twist o personalizado, le recomendamos encarecidamente que verifique la secuencia de la construcción final utilizando el botón para descargar secuencias en el diseñador:

Tenga en cuenta que, una vez que se ha realizado un pedido de genes, no podemos alterar la secuencia de ninguna manera; si descubre un error en su estructura, contacte con customersupport@twistbioscience.com para obtener ayuda.

Proporcione 10 ug de ADN del vector a una concentración de 100 ng/ul en al menos 100 ul. Una cantidad insuficiente de ADN del vector provocará un retraso en el proceso de incorporación.

No, debe incluir la secuencia completa del vector enviado a Twist. Usamos esta información para el control de calidad de la secuencia y para confirmar la estrategia de clonación. Secuenciaremos su vector y lo compararemos con la secuencia que nos envió. Los errores o discrepancias entre los dos resultados de la secuencia pueden retrasar la incorporación de vectores.

Deberá cargar la secuencia completa del vector en formato GenBank con la secuencia completa del plásmido que se enviará a Twist. Twist secuenciará el vector entrante para garantizar que las secuencias coincidan. Cualquier discrepancia retrasará el proceso de incorporación.

Asegúrese de que su vector cumpla con los requisitos siguientes:

• Volumen vectorial ≥ 100 ul (el material plasmídico no se puede enviar en papel de filtro)
• Concentración de vector ≥ 100 ng/ul
• Masa del vector 10 ug
• Debe tener un origen de replicación bacteriano (no en un número de copias bajo)
• Debe ser población clonal
• Debe ser circular
• Debe tener un marcador de resistencia a antibióticos
• No debe contener homopolímeros/secuencia repetitiva > 9 pb dentro de los 40 pb del sitio de inserción
• Repeticiones: debe contener al menos 40 pb de secuencia única sin repeticiones directas o invertidas > 19 pb antes y después del sitio de inserción
• No debe contener ccdB en el producto genético final
• Debe poder linealizar por el sitio de la enzima de restricción dentro de los 50 pb del sitio de inserción
• Debe ser compatible con BSL-1

Resistencia a antibióticos:

El plásmido debe contener uno de los siguientes marcadores de resistencia a antibióticos para la E. coli. Las concentraciones estándar están a continuación:

Líneas celulares (E. coli)       

• Línea celular disponible en producción        
• Cepa de clonación similar a DH10Beta   
• Cepa similar a Stbl3 (se puede cultivar a 37 ℃)        

Número de copias              

Solo se permiten los orígenes de replicación constitutivos.

Condiciones de crecimiento     

• Temperatura estándar: 37 ℃/30 ℃   
• Tiempo estándar: Noche/24 horas         
• Las colonias en placa deben alcanzar un tamaño compatible con la automatización después de 16 horas/24 horas de crecimiento en LB-Lennox.

Notificaremos al cliente si encontramos una inserción/eliminación de más de 100 pb en la columna vertebral del vector. Si hay una inserción/eliminación/mutación de 200 pb antes o después del sitio de inserción, informaremos al cliente. 

Twist secuenciará el vector entrante, sin embargo, solo se analizará la región que rodea el sitio de inserción (dentro de 200 pb a cada lado del sitio de inserción) para detectar discrepancias entre lo que se indica como secuencia de referencia del vector en el formulario de incorporación del vector personalizado recibido y los datos de CC.

Informaremos si la secuencia no coincide o si se observan grandes eliminaciones o inserciones (> 100 pb) en comparación con la secuencia de referencia del vector proporcionada por el cliente. Tenga en cuenta que, actualmente, no informamos sobre SNP fuera de los 200 pb a cualquiera de los lados del sitio de inserción.

Si se encuentra alguna desviación de la secuencia de referencia de vector, esto podría retrasar el tiempo de finalización para la incorporación.