Fragmentos de genes multiplexados

Twist utiliza la química de la fosforamidita para la síntesis. En comparación con los sintetizadores convencionales basados en columnas, nuestra plataforma de síntesis miniaturiza el proceso de síntesis, lo que reduce los volúmenes de reacción y aumenta el rendimiento. Este proceso se ha optimizado a lo largo de los años y ahora permite a Twist imprimir grupos de hasta 500 nucleótidos de longitud. Después de la síntesis, tenemos un flujo de trabajo de amplificación optimizado para generar los fragmentos de genes multiplexados en un formato de ADNbc.

Los fragmentos de genes multiplexados (MGF) de Twist ofrecen un formato agrupado único para hasta cientos de miles de fragmentos de genes de ADN bicatenario, de entre 301 y 500 pares de bases de longitud. Este formato agrupado de fragmentos permite aplicaciones de cribado de alto rendimiento, como la edición primaria, el cribado funcional ultracomplejo basado en CRISPR, la ingeniería de péptidos y proteínas, el descubrimiento de anticuerpos (Ac) y los ensayos reporteros masivamente paralelos (MPRA), en los que el coste por fragmento puede ser un obstáculo para el número deseado de variantes.

Twist utiliza un flujo de trabajo de amplificación optimizado para generar los fragmentos de genes multiplexados en un formato de ADNbc que mitiga el riesgo de resultados de amplificación deficientes, ya que la amplificación por PCR del material sintetizado puede ser muy complicada.

There are no complexity requirements for MGF. No obstante, algunas características pueden dar lugar a resultados que no sean óptimos:

1. Características como las repeticiones directas y las secuencias conservadas compartidas por todas las variantes pueden provocar cierta recombinación durante la amplificación.
2. Los homopolímeros largos (>20 pb) pueden provocar algunas pérdidas durante la amplificación.
3. Las horquillas fuertes pueden dar lugar a una amplificación deficiente, lo que puede conducir a una subrepresentación o pérdida de esas variantes.

No, todos los fragmentos del grupo deben tener las mismas secuencias de flancos. Se pueden conseguir varios conjuntos de flancos solicitando varios grupos. Como alternativa, puede diseñar un único grupo con flancos internos que sean diferentes y flancos externos que sean universales para que Twist los utilice para la amplificación. A continuación, puede amplificar los subgrupos; aunque esto conlleva el riesgo inherente de sesgar la uniformidad y/o quedarse sin material de plantilla.

No, solo podemos sintetizar secuencias que contienen las cuatro bases estándar A, C, G y T. El uso de bases degeneradas (R, Y, S, W, K, M, B, D, H, V, N) no está permitido. No obstante, si desea tener las cuatro bases (o un subconjunto de bases) en una posición determinada en un fragmento, puede diseñar fragmentos independientes, cada uno con una base diferente en el sitio de interés.

Sí, podemos añadir flancos estándar de Twist a sus fragmentos que pueden utilizarse con clonación por restricción.

Paso 1: Descargue el formulario de envío de MGF y rellene todos los campos para el diseño de su MGF.  

Paso 2: Suba aquí el formulario de envío cumplimentado.  

Si tiene algún problema o alguna consulta, póngase en contacto con nosotros por correo electrónico (customersupport@twistbioscience.com) o chat.

Tenga en cuenta las reglas estándar para el diseño de cebadores:

1. Longitud de 20-25 pb
2. 35-70 % de contenido de G/C
3. Temperatura de fusión (Tm) de 55-60 °C
4. Los pares de cebadores deben tener una Tm con una diferencia de 5 °C entre sí
5. Los pares de cebadores no deben tener regiones complementarias
6. Evitar sitios internos de unión del cebador en la región variable

1. La longitud del fragmento puede oscilar entre 301 y 500 nucleótidos (incluidos los flancos constantes).
2. La longitud total del fragmento no puede superar los 500 nucleótidos, incluidos los flancos constantes que se utilizarán para la amplificación por PCR. Las secuencias flanqueantes deben tener al menos 20-25 pb de longitud, lo que permitirá hasta 460 pb de región de codificación variable. 
3. La variación de la longitud de los fragmentos del más corto al más largo no debe superar los 80 pb (por ejemplo, si el fragmento más largo tiene 400 pb, el más corto debe tener más de 320 pb).

El tiempo de entrega para los fragmentos de genes multiplexados es de 8 a 12 días laborables.

El precio depende del nivel de complejidad (tamaño del grupo) y del rango de longitud del fragmento (301-350 nucleótidos, 351-400 nucleótidos, 401-450 nucleótidos y 451-500 nucleótidos).

1. La electroforesis capilar se realiza en el grupo final para determinar la pureza de la muestra. Al menos el 90 % de las moléculas del grupo deben tener la longitud esperada.
2. La cuantificación basada en fluorescencia se realiza en la muestra final para garantizar que haya al menos 200 ng de material.
3. Twist no realiza ninguna secuenciación en el grupo, y no garantiza la calidad en términos de representación o tasa de error. No obstante, hemos visto durante el desarrollo que la mayoría de los grupos tienen un percentil 90/10 de <3 y una tasa de error media de ~1:2000.

Los fragmentos de genes multiplexados se suministran como ADN bicatenario amplificado, como producto liofilizado agrupado en un único tubo.

1. Los fragmentos de genes multiplexados no modificados son estables. Para almacenamiento a largo plazo (hasta un año), congele el ADN a -20 °C. Para un almacenamiento aún más prolongado, congele el ADN a -80 °C.
2. Si los fragmentos se almacenan en solución, evite los ciclos repetidos de congelación-descongelación, ya que este proceso puede conducir a la degradación física de los fragmentos.
3. Si se planean numerosos experimentos, tome alícuotas de la muestra y almacénelas a -20 °C.
4. Se recomienda una manipulación cuidadosa para evitar una posible contaminación con nucleasas o bacterias.

Directrices de resuspensión:

• Para la resuspensión, centrifugue brevemente el tubo antes de su apertura, y resuspenda en amortiguador Tris-EDTA (TE) libre de nucleasas, pH 8,0 o Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 hasta la concentración deseada.
• Se recomienda una concentración de al menos 10 ng/μl para la dilución de la solución madre, pero la concentración óptima deberá determinarse en función de la aplicación deseada.
• Prepare alícuotas de la solución madre y separe las alícuotas de trabajo para limitar las posibilidades de contaminación y reducir el número de ciclos de congelación/descongelación. Use alícuotas de trabajo tan pronto como sea posible después de la preparación y minimice la exposición a altas temperaturas.

ADN resuspendido

• Twist recomienda almacenar el ADN resuspendido durante los períodos siguientes según las condiciones de almacenamiento.
  • Temperatura ambiente durante 3 meses.
  • 4 °C durante 12 meses.
  • -20 °C durante 24 meses.
  • -80 °C para conservación a largo plazo.

Twist Bioscience ships Multiplexed Gene Fragments dried down in tubes at ambient temperature. El ADN bicatenario es estable en la mayoría de las condiciones estándar de almacenamiento en laboratorio. Sin embargo, es importante considerar las prácticas recomendadas siguientes para mantener la alta calidad del ADN sintetizado por Twist Bioscience.

• Twist recomienda almacenar el ADN deshidratado durante los períodos siguientes según las condiciones de almacenamiento.
  • Temperatura ambiente durante 3 meses.
  • 4 °C durante 12 meses.
  • -20 °C durante 24 meses.
  • -80 °C para conservación a largo plazo.