Kits de secuenciación de última generación (NGS)

Sí, son las mismas microesferas, solo diferentes volúmenes de llenado.

Para adaptadores de índice doble combinatorios y únicos, se utilizan las secuencias siguientes para el recorte del adaptador: Lectura 1: AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA Lectura 2: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT

Twist Bioscience garantiza los kits durante un mínimo de 3 meses a partir de la fecha de envío. 

Las fichas de datos de seguridad se pueden descargar de nuestra página web, aquí. 

Tenga en cuenta que, en nuestra página web, solo tenemos documentos SDS para productos de secuenciación de última generación (NGS); para documentos SDS para nuestros productos de biología sintética, envíenos un correo electrónico a customersupport@twistbioscience.com.

Sí, los adaptadores Twist son compatibles con fragmentos de ADN generados por fragmentación enzimática o mecánica.

Sí, los kits de preparación de bibliotecas Twist son adecuados para crear bibliotecas para la secuenciación del genoma completo.

Como la mayoría de las aplicaciones de SGC utilizan longitudes de lectura más largas (2 × 151 para la secuenciación de genomas completos en lugar de 2 × 101 o 2 × 76 para la secuenciación de exomas completos), las condiciones de fragmentación deben cambiarse para adaptarse a longitudes de fragmentos más largas.

Para los kits de fragmentación enzimática, la longitud depende de tres factores: tiempo, temperatura y ADN proporcionado.

Para la fragmentación mecánica, deben establecerse las condiciones (tiempo, potencia, factor de trabajo y ciclos por ráfaga) para adaptarse a fragmentos de mayor longitud.

Sí, Twist vende componentes del kit de secuenciación de última generación (NGS) para permitir la máxima flexibilidad. Puede obtener una lista completa de los componentes que se pueden pedir iniciando sesión en su cuenta de Twist. Puede solicitar los siguientes componentes:

 Componentes de preparación de bibliotecas      

• PN 100253: KIT 1 EF DE PREPARACIÓN DE BIBLIOTECAS TWIST, 16 MUESTRAS    
• PN 100875: KIT 1 MF DE PREPARACIÓN DE BIBLIOTECAS TWIST, 16 MUESTRAS   
• PN 100401: KIT 2 DE PREPARACIÓN DE BIBLIOTECAS TWIST, 16 MUESTRAS                     
• PN 100572: KIT 1 EF DE PREPARACIÓN DE BIBLIOTECAS TWIST, 96 MUESTRAS    
• PN 100876: KIT 1 MF DE PREPARACIÓN DE BIBLIOTECAS TWIST, 96 MUESTRAS   
• PN 100573: KIT 2 DE PREPARACIÓN DE BIBLIOTECAS TWIST, 96 MUESTRAS                     

Adaptadores combinatorios        

• PN 100255: 16 MUESTRAS 

Adaptadores de índice doble único         

• PN 101307: SISTEMA DE ADAPTADOR UNIVERSAL TWIST, 16 MUESTRAS    
• PN 101308: SISTEMA DE ADAPTADOR UNIVERSAL TWIST, 96 MUESTRAS, PLACA A           
• PN 101309: SISTEMA DE ADAPTADOR UNIVERSAL TWIST, 96 MUESTRAS, PLACA B
• PN 101310: SISTEMA DE ADAPTADOR UNIVERSAL TWIST, 96 MUESTRAS, PLACA C
• PN 101311: SISTEMA DE ADAPTADOR UNIVERSAL TWIST, 96 MUESTRAS, PLACA D

Bloqueadores         

• PN 100856: BLOQUEADORES UNIVERSALES TWIST, 2 REACCIONES   
• PN 100578: BLOQUEADORES UNIVERSALES TWIST, 12 REACCIONES 
• PN 100767: BLOQUEADORES UNIVERSALES TWIST, 96 REACCIONES             

* Reactivos de hibridación         

• PN 101263: REACTIVOS DE HIBRIDACIÓN, 2 REACCIONES      
• PN 100930: REACTIVOS DE HIBRIDACIÓN, 12 REACCIONES    
• PN 100982: REACTIVOS DE HIBRIDACIÓN, 96 REACCIONES    

* Reactivos de hibridación rápida  

• PN 101260: REACTIVOS DE HIBRIDACIÓN RÁPIDA, 2 REACCIONES         
• PN 100964: REACTIVOS DE HIBRIDACIÓN RÁPIDA, 12 REACCIONES       
• PN 100968: REACTIVOS DE HIBRIDACIÓN RÁPIDA, 96 REACCIONES       

* Amortiguadores de lavado 

• PN 101264: AMORTIGUADORES DE LAVADO, 2 REACCIONES 
• PN 100985: AMORTIGUADORES DE LAVADO, 12 REACCIONES          
• PN 100846: AMORTIGUADORES DE LAVADO, 96 REACCIONES          

* Amortiguadores de lavado rápido      

• PN 101261: AMORTIGUADORES DE LAVADO RÁPIDO, 2 REACCIONES    
• PN 100971: AMORTIGUADORES DE LAVADO RÁPIDO, 12 REACCIONES  
• PN 100972: AMORTIGUADORES DE LAVADO RÁPIDO, 96 REACCIONES  

Microesferas de purificación y unión          

• PN 101262: MICROESFERAS DE PURIFICACIÓN Y DE ESTREPTAVIDINA, 2 REACCIONES      
• PN 100983: MICROESFERAS DE PURIFICACIÓN Y DE ESTREPTAVIDINA, 12 REACCIONES    
• PN 100984: MICROESFERAS DE PURIFICACIÓN Y DE ESTREPTAVIDINA, 96 REACCIONES   

* Nota: Los reactivos de hibridación estándar solo deben usarse con amortiguadores de lavado estándar; por el contrario, los reactivos de hibridación rápida solo deben utilizarse con amortiguadores de lavado rápido. La mezcla de amortiguadores de hibridación estándar y de lavado rápido (y viceversa) dará como resultado un rendimiento deficiente. 

Sí, además de nuestros kits de fragmentación mecánica, Twist también ofrece los siguientes kits de preparación de bibliotecas para usar con la fragmentación enzimática:

100253: kit de preparación de bibliotecas Twist, fragmentación enzimática, 16 muestras (incluye enzimas y amortiguadores)

101059: kit de preparación de bibliotecas Twist, fragmentación enzimática, 16 muestras (incluye enzimas, amortiguadores y microesferas de purificación)

100572: kit de preparación de bibliotecas de Twist, fragmentación enzimática, 96 muestras (incluye enzimas y amortiguadores)

101058:  kit de preparación de bibliotecas de Twist, fragmentación enzimática, 96 muestras (incluye enzimas, amortiguadores y microesferas de purificación)

Nota para la preparación de bibliotecas, también necesitará adaptadores:

101307: sistema de adaptador universal Twist, 16 muestras

101308: Sistema de adaptador universal Twist, 96 muestras, placa A

101309: sistema de adaptador universal Twist, 96 muestras, placa B

101310: sistema de adaptador universal Twist, 96 muestras, placa C

101311: sistema de adaptador universal Twist, 96 muestras, placa D

Sí, además de nuestros kits de fragmentación enzimática, Twist también ofrece los siguientes kits de preparación de bibliotecas para usar con la fragmentación mecánica:

100875: kit de preparación de bibliotecas Twist, fragmentación mecánica, 16 muestras (incluye enzimas y amortiguadores)

101280: kit de preparación de bibliotecas Twist, fragmentación mecánica, 16 muestras (incluye enzimas, amortiguadores y microesferas de purificación)

100876: kit de preparación de bibliotecas Twist, fragmentación mecánica, 96 muestras (incluye enzimas y amortiguadores)

101281: kit de preparación de bibliotecas Twist, fragmentación mecánica, 96 muestras (incluye enzimas, amortiguadores y microesferas de purificación)

Nota para la preparación de bibliotecas, también necesitará adaptadores:

101307: sistema de adaptador universal Twist, 16 muestras

101308: Sistema de adaptador universal Twist, 96 muestras, placa A

101309: sistema de adaptador universal Twist, 96 muestras, placa B

101310: sistema de adaptador universal Twist, 96 muestras, placa C

101311: sistema de adaptador universal Twist, 96 muestras, placa D

El tamaño medio recomendado del fragmento objetivo es de 200 pb; esto dará como resultado un tamaño de biblioteca promedio de aproximadamente 350 pb; sin embargo, debe ajustar el tamaño de su inserto de acuerdo con las longitudes de lectura de la secuencia.  

Twist ofrece kits completos* para la fragmentación enzimática y la fragmentación mecánica; tenga en cuenta que estos kits no incluyen un panel de enriquecimiento:

Fragmentación enzimática            

• PN 101897: PREPARACIÓN DE LA BIBLIOTECA EF TWIST + HIBRIDACIÓN ESTÁNDAR Y UDI, 16x2 REACCIONES          
• PN 101896: PREPARACIÓN DE LA BIBLIOTECA EF TWIST + HIBRIDACIÓN RÁPIDA Y UDI, 16x2 REACCIONES     
• PN 101901: PREPARACIÓN DE LA BIBLIOTECA EF TWIST + HIBRIDACIÓN ESTÁNDAR Y UDI, 96x12 REACCIONES       
• PN 101900: PREPARACIÓN DE LA BIBLIOTECA EF TWIST + HIBRIDACIÓN RÁPIDA Y UDI, 96x12 REACCIONES    

Fragmentación mecánica        

• PN 101899: PREPARACIÓN DE LA BIBLIOTECA MF TWIST + HIBRIDACIÓN ESTÁNDAR Y UDI, 16x2 REACCIONES       
• PN 101898: PREPARACIÓN DE LA BIBLIOTECA MF TWIST + HIBRIDACIÓN RÁPIDA Y UDI, 16x2 REACCIONES    
• PN 101903: PREPARACIÓN DE LA BIBLIOTECA MF TWIST + HIBRIDACIÓN ESTÁNDAR Y UDI, 96x12 REACCIONES     
• PN 101902: PREPARACIÓN DE LA BIBLIOTECA MF TWIST + HIBRIDACIÓN RÁPIDA Y UDI, 96x12 REACCIONES

* Nota: Debe comprar KAPA® HiFi HotStart ReadyMix (Kapa Biosystems®, #KK2601) o su equivalente para generar y amplificar bibliotecas.

Si asumimos una entrada de 50 ng de ADN, el coeficiente de adaptador frente a ADN es de aproximadamente 200:1.

The TrueAmp Library Preparation Kit is designed for flexible DNA library construction across a wide range of sample types and input amounts. It supports an integrated workflow where fragmentation, end repair, and dA-tailing are performed in a single enzyme mix, simplifying the overall process.

The kit performs robustly across diverse DNA inputs, including FFPE samples or samples with varying GC content and is compatible with DNA in common storage buffers such as TE, Tris-HCl, or water.

It also enables consistent and reliable fragmentation using a single standardized protocol, while also allowing users to tune insert size by adjusting incubation time or temperature. The streamlined workflow can be completed in approximately 3 hours, with less than 15 minutes of hands-on time, and is designed to maximize library yield through high reaction efficiency and minimal sample loss.

The TrueAmp Library Preparation Kit supports a broad range of DNA input amounts, from as low as 100 pg up to 1 µg. This flexibility enables reliable library preparation across low-input and high-input sample types.

No, the TrueAmp Library Preparation Kit is not compatible with bisulfite conversion or EM-seq workflows. The enzymatic steps in the TrueAmp Library Preparation workflow include DNA repair, which can alter or remove native methylation signatures.

For methylation-sensitive applications such as bisulfite or EM-seq, we recommend using mechanical shearing (e.g., sonication) followed by the Twist cfDNA Library Preparation Kit, which is better suited for preserving methylation information.

The TrueAmp Library Preparation Kit is not recommended for cfDNA workflows. Since cfDNA is already fragmented, the enzymatic fragmentation step is unnecessary. While it is possible to skip fragmentation and proceed with end repair and dA-tailing, the one-pot workflow may not deliver optimal conversion efficiency for these short fragments.

For best performance and highest library conversion from cfDNA, we recommend using the Twist cfDNA Library Preparation Kit, which is specifically optimized for cell-free DNA.

Yes, the TrueAmp Library Preparation Kit performs well with degraded and FFPE-derived DNA. The workflow includes DNA repair activity, which can help restore damaged bases commonly found in FFPE samples.

As a result, users often observe improved library yield and recovery compared to workflows without repair. Some optimization (e.g., fragmentation time, PCR cycles) may be required depending on sample quality.

Sí. The TrueAmp fragmentation chemistry is broadly compatible with a range of double-stranded DNA inputs, including genomic DNA (gDNA), plasmids, and PCR-derived amplicons. Under consistent reaction conditions, high-quality DNA substrates, regardless of origin, typically yield comparable fragment size distributions, indicating minimal sequence or topology-dependent bias.

During development, fragmentation performance was evaluated using DNA ladders spanning a wide range of fragment sizes. This study demonstrates that the enzymatic fragmentation preferentially processes larger DNA molecules while maintaining representation of shorter fragments, resulting in a controlled size distribution without significant loss of diversity across the input population.

Yes, the TrueAmp Library Preparation Kit is well suited for targeted enrichment workflows, including hybrid capture applications. It generates high library yields and promotes uniform molecule conversion, which supports efficient and consistent downstream target capture performance.

Yes, the TrueAmp Library Preparation Kit is compatible with liquid handling automation platforms such as Hamilton systems. The streamlined workflow, reduced number of steps, and minimal hands-on time make it well suited for automation. Minor optimization (e.g., mixing, bead handling, or liquid classes) may be required depending on the platform and configuration.

No. The enzymatic fragmentation chemistry is designed to produce consistent fragment sizes across the recommended input range, so fragmentation time and temperature do not need to be adjusted based on DNA mass.

Under the same conditions, samples with similar DNA quality ranging from 0.1 ng to 500 ng will generate comparable fragment size distributions. As demonstrated above, human genomic DNA inputs from 0.1 ng to 500 ng fragmented at 32°C for 22 minutes produced similar final library sizes (~450–480 bp), with PCR cycle number increasing as input mass decreased.

Input DNA quality directly affects fragment size. High-quality, intact DNA produces predictable insert sizes, while degraded or pre-sheared DNA (e.g., FFPE) typically results in shorter fragments under the same conditions. In these cases, reducing fragmentation time or temperature and applying size selection may help achieve the desired insert size.

Fragment size can be controlled by adjusting fragmentation reaction temperature and incubation time. Increasing either parameter generally results in shorter DNA fragments, while reducing them produces longer fragments.

Because fragmentation performance can vary depending on thermocycler calibration, DNA input quality, and storage buffer composition, we recommend performing a small design of experiments (DOE) with your specific samples to determine optimal conditions prior to scaling up.

For additional guidance and example data, please refer to the Twist TrueAmp Library Preparation Kit technical note on insert size optimization.

Yes, fragmented and end-prepped DNA can be safely stored at either 4 °C or -20 °C (e.g., overnight) prior to ligation without any appreciable impact on library preparation performance as compared to samples processed immediately. This has been validated across technical replicates (n=3), where samples were stored under these conditions before ligation and showed consistent results.

Sí. Vortexing the 10X Twist Fragmentation Enzyme Mix prior to use is important to ensure the solution is fully homogeneous. Failure to properly mix the enzyme solution may lead to variability in fragmentation performance and inconsistent results.

The TrueAmp Library Preparation Kit is designed for flexibility and is compatible with a wide range of 3′ T-overhang adapters. Note that adapter quality impacts overall library preparation efficiency. For optimal performance, we recommend using validated Twist adapter systems:

●        Twist Universal Adapter System (SKU: 101308)

○    Requires PCR amplification with indexed primers to complete library construction.

●        Twist UMI Adapter System (SKU: 105041)

○        Requires PCR amplification with indexed primers.

○        Enables incorporation of Unique Molecular Identifiers (UMIs) for improved error correction and duplicate handling.

●        Twist Full-Length UDI Adapters (SKU: 107376)

○        Do not require PCR for index incorporation, as full-length P5/P7 sequences and indices are already present.

○        Optional PCR may still be performed for library amplification if additional yield is needed.

All three systems are fully compatible with the TrueAmp workflow. Selection should be based on your application needs (e.g., UMI requirements, workflow, or PCR-free indexing preference).

Adapter input should be adjusted based on DNA input amount and fragment size to maintain sufficient adapter-to-insert molar excess for efficient ligation while minimizing adapter-dimer formation. Twist Universal Adapters are supplied at 10 µM and recommended conditions in the protocol are designed to maintain an adapter-to-insert molar ratio of approximately ≥150:1 for robust ligation efficiency across a broad range of inputs. Too little adapter may reduce library conversion and yield, while excessive adapter can increase adapter-dimer carryover, particularly in low-input samples.

If optimization is required, titrate adapter input while monitoring final library yield and adapter-dimer levels. The optimal condition is the lowest adapter amount that maintains strong library yield with minimal adapter dimer.

For ultra-low input samples (<1 ng), additional optimization may be required to balance ligation efficiency against adapter-dimer formation, as reduced insert mass increases the likelihood of adapter self-ligation products. Conversely, for higher DNA input amounts, increasing adapter concentration beyond the recommended range may further improve ligation efficiency in some workflows.

Yes, contaminants such as salts, EDTA, ethanol, detergents, and extraction reagent carryover can impact enzymatic fragmentation. These may either inhibit or enhance enzyme activity, leading to inconsistent or shifted fragment sizes.

In some cases, fragmentation can be tuned by adjusting incubation time or temperature to compensate. However, if inhibitors significantly disrupt enzyme activity and no library is generated, we recommend performing an additional DNA cleanup before library preparation.

Three independent manufacturing lots were evaluated to assess fragmentation variability, with an additional operator performing replicate testing on a separate day to characterize operator-to-operator effects.

Fragmentation with the TrueAmp Library Preparation Kit demonstrates high reproducibility within a given lot, with technical replicates (n=8) showing tight fragment size distributions and a standard deviation of ~7–10 bp (~2% CV). Across manufacturing lots, modest shifts in the mean fragment size are observed (~30–40 bp, or ~5–8% deviation), while maintaining consistent distribution shape and overall library performance. Operator-to-operator variability can introduce similar shifts in the average fragment size, as observed within the same lot; however, these differences should not meaningfully impact the distribution profile or downstream performance. 

Sí. The TrueAmp reagents have been tested through up to four freeze-thaw cycles with no observed impact on performance. These studies were conducted over multiple days to reflect typical laboratory use. As a best practice, repeated freeze–thaw cycles should still be minimized when possible.

The TrueAmp Library Preparation Kit has a shelf life of 12 months when stored as recommended. This is supported by accelerated aging studies conducted over 13 months, which showed no measurable impact on performance or stability.

Yes, we offer flexible customization options to support a wide range of specialized requirements or unique applications. For more information or to discuss your specific requirements, please contact our team.

The TrueAmp Library Preparation Kit is not recommended for workflows where DNA is already sheared or where native DNA modifications must be preserved. This includes applications such as cfDNA library preparation and methylation-sensitive workflows (e.g., bisulfite or EM-seq). For these use cases, alternative workflows or kits optimized for those applications are recommended.

The insert is the DNA of interest generated during fragmentation. The insert size refers to the length of this DNA region. The fragment (or sequencing fragment/library) includes the insert plus the sequencing adapters ligated to both ends. Therefore, fragment size = insert size + adapter sequences. Traditional adapter sequences are roughly 65-70nt long but dependent on the presence of UMIs or length of indexes. In paired-end sequencing, reads are generated from both ends of the insert. If the insert is longer than the combined read length, a portion in the middle remains unsequenced. If the insert is shorter, reads may overlap or extend into adapter sequences.

Insert size impacts library yield, sequencing performance, and downstream applications. Smaller fragments typically amplify more efficiently and can result in higher yields, while larger fragments may reduce cluster generation efficiency on some sequencing platforms. Insert size also influences data quality metrics such as coverage uniformity, duplication rates, and alignment efficiency.

This is especially true in targeted enrichment workflows, including multiplexed captures, where the same mass input (e.g., 500 ng) represents a different number of molecules depending on fragment size.  Smaller libraries contain more molecules than larger ones at the same mass, which can affect capture efficiency and sample balance.

Additionally, larger insert sizes in target enrichment workflows can increase the proportion of near-bait reads, as longer fragments extend beyond the probe-binding region. Insert size should also be considered relative to sequencing read length. For paired-end sequencing (e.g., 2×75 bp or 2×150 bp), inserts that are too short may result in overlapping reads or sequencing into adapter regions, reducing usable data. Selecting an appropriate and consistent insert size for your application helps ensure optimal sequencing performance and reliable downstream analysis.

Shorter-than-expected fragments typically result from degraded or pre-sheared input DNA, excessive fragmentation time or temperature, or buffer components (e.g., salts) that increase enzymatic activity. We recommend reducing fragmentation time or temperature and confirming input DNA quality to help achieve the desired insert size. If needed, performing a cleanup step prior to library preparation may improve consistency.

If your DNA has been sufficiently fragmented, the presence of multiple peaks, especially those appearing larger than the expected fragment size, is typically an artifact of library preparation rather than true size distribution:

1. PCR overamplification and heteroduplex formation.
During excessive PCR cycling, DNA strands from different templates can anneal to each other, forming heteroduplexes. These structures migrate more slowly during capillary electrophoresis (e.g., TapeStation or Bioanalyzer), which can create the appearance of larger fragment sizes or additional peaks.

For additional information, please refer to the technical note on heteroduplexes: https://www.twistbioscience.com/resources/white-paper/heteroduplexes-affect-library-size-determination-without-impacting-targeted

Overcycling can introduce heteroduplex artifacts in adapter-ligated libraries. Samples of the gDNA library were subjected to 2x increments in rounds of PCR amplification. Top/Middle: Schematic of homoduplex and heteroduplex formation during PCR amplification. With appropriate amplification, library molecules form homoduplex products. With excessive PCR cycling, related but non-identical library molecules can misanneal, forming heteroduplex species that migrate aberrantly during electrophoresis. Bottom: Bioanalyzer electropherograms representing increasing PCR cycles (left to right, 4 - 12 cycles). PCR libraries show progressively broad, irregular peaks and apparent high-molecular-weight species, consistent with heteroduplex formation from overamplification.

2. Adapter structure effects (full-length Y adapters)
Libraries constructed with full-length Y adapters (containing both P5 and P7 sequences) can exhibit altered migration behavior due to their partially single-stranded structure. This can cause fragments to appear larger than their true size during electrophoretic analysis.

These 2 effects can be validated by performing a short “reconditioning PCR”: Use a small number of cycles (e.g., 2–5 cycles) with the inclusion of a high concentration of primers
This step promotes the formation of fully matched homoduplexes, which migrate more accurately during electrophoresis. After this treatment, the apparent fragment size distribution should shift closer to the expected profile.

Resolution of library fragment size following PCR amplification. 250ng of gDNA was fragmented at 25°C for 15 mins for a PCR-free protocol (A) TapeStation trace of a library immediately following ligation of Twist Full-Length UDI Adapters. The electropherogram shows multiple broad and irregular peaks, reflecting heterogeneous migration behavior caused by the Y-shaped adapter structure. These structural features can result in apparent high-molecular-weight species and poor size resolution. (B) TapeStation trace of the same library after 3 cycles of PCR amplification. PCR converts adapter-ligated molecules into fully double-stranded homoduplex products, resolving structural heterogeneity and yielding a defined fragment size distribution.

Low library yield can result from low input DNA, poor DNA quality, over- or under-fragmentation, or the presence of inhibitors that affect enzymatic steps. Additional factors such as improper size selection, incomplete ethanol removal, over-dried SPRI beads, or insufficient mixing during reactions may also reduce yield. Ensuring clean DNA input, optimizing fragmentation conditions, and following recommended SPRI handling and mixing practices should improve performance.

Adapter dimers or short fragments are typically observed with low input DNA, excess adapter concentration, or insufficient size selection. Additional causes include improper adapter handling (e.g., degradation or incorrect dilution) or pre-mixing adapters with ligation reagents. Optimizing adapter concentration, ensuring proper adapter handling, and performing appropriate SPRI cleanup (e.g., adjusting bead ratios or repeating cleanup) can help reduce these artifacts.

As a general starting point, the baseline fragmentation times and temperatures in the protocol are recommended to achieve insert sizes in the 200-250 bp range. Fragmentation behavior can vary depending on thermocycler calibration, DNA quality, and buffer composition. For best results, we recommend performing a small time-course optimization (DOE) using your specific samples and follow this decision tree for optimization of the target insert size.

The number of PCR cycles depends on input DNA amount and desired library yield. Lower input samples typically require more cycles to generate sufficient material, while higher input samples require fewer cycles to minimize duplication and preserve library complexity. Optimization may be required to balance yield and sequencing performance.

Un aptámero de arranque en caliente forma una estructura secundaria a bajas temperaturas (como RT o durante la configuración en la mesa de trabajo). Esta estructura secundaria se une a la enzima polimerasa e inactiva la actividad enzimática. A temperaturas más altas (como durante el termociclado por PCR), la estructura secundaria del aptámero se desnaturaliza y libera la enzima retenida.  

Como parte de nuestro proceso de control de calidad, integramos una retención de incubación de 10 horas a 37 °C para garantizar que la configuración de baja temperatura no afecte al rendimiento. 

La nueva mezcla de polimerasa TrueAmp Twist está diseñada y optimizada para un rendimiento alto y sólido, lo que le permite amplificar de forma eficiente ADN de baja entrada hasta 100 fg y entradas estándar, lo que proporciona una solución única y fiable en diversos tipos de muestras.

The Twist TrueAmp Polymerase is engineered for enhanced proofreading, resulting in an ultra-low error rate and significant reduction in sequencing artifacts such as C>T substitutions. Internal testing has shown an absolute error rate of 1.17 × 10⁻⁶. Please take a look at our product sheet for more information.

Hemos demostrado un rendimiento de secuenciación de lectura larga comparable al de las polimerasas líderes del mercado actuales y se puede utilizar como sustituta directa, pero ahora estamos cambiando nuestro desarrollo para especializarnos exclusivamente en soluciones de lectura larga de alta fidelidad.

La mezcla de polimerasa TrueAmp Twist es solo para uso en investigación.

La mezcla de polimerasa TrueAmp Twist se envía y debe almacenarse a –20 °C.

La mezcla de polimerasa TrueAmp Twist está clasificada para hasta 20 ciclos de congelación/descongelación sin cambios en el rendimiento. La mezcla es estable durante 2 años.

Sí, la ligasa sintetizada no se basa en agentes aglomerantes, como el PEG, para una ligadura máxima. PEG is automation-unfriendly, increases variability/viscosity, and negatively impacts downstream bead-based purification (SPRI). Recomendamos una SPRI 0,9X como el coeficiente óptimo para la recuperación de ADNlc (~150-167 pb). For shorter cfDNA fragments, we recommend increasing the SPRI ratio to 1.0X or 1.1X.

Sí, el protocolo recomendado del kit permite un volumen de entrada de ADNlc de 35 μl. Se han probado entradas de volúmenes mayores de hasta 50 μl sin un impacto negativo en el rendimiento del kit. En este escenario recomendamos reducir el volumen de agua en la reacción de ligadura para compensar el mayor volumen en la reparación de los extremos. 

No, el kit puede gestionar un amplio intervalo de entradas de muestras desde 0,5 ng hasta 500 ng.

Las cantidades de adaptador y los ciclos de PCR deberán variar en función de las cantidades de entrada de masa.  

Sí. The kit can be used with low input DNA samples that do not need fragmentation, or with pre-fragmented input DNA such as samples derived from FFPE material.

In tests performed with moderate DIN (3-5) FFPE curls from 4 sample sources (HG002, HG003, HG004, and Structural Multiplex Standard),  results show that the cfDNA library preparation kit can be used on FFPE material and adapted for solid tumor workflows using cfDNA Library Prep Kit and the standard hybridization v2 protocol.

Note that DNA fragmentation is still necessary even for samples with a DIN score <2. Additionally, DNA input ranges will need to be increased to accommodate the availability of DNA from FFPE extraction (~100-500 ng per 15 μm curl).

Recomendamos analizar la distribución del tamaño del ADNlc de entrada con una prueba electroforesis en gel, como un kit de ADN de alta sensibilidad del bioanalizador (Agilent), para garantizar que no presente ADN de alto peso molecular (HMW) procedente de la extracción de ADNlc. HMW DNA will negatively impact the accurate quantification of cfDNA input amounts. We also recommend quantifying input cfDNA with a Qubit high-sensitivity dsDNA assay (Thermofisher) for accurate DNA quantification. 

Sí, el kit preparara bibliotecas de ADNlc con UMI.

Hemos determinado que la masa de entrada de la biblioteca en el enriquecimiento del objetivo puede afectar a la complejidad de bibliotecas muy secuenciadas y este multiplicador se determinó con datos empíricos. Este enfoque garantiza una efectividad máxima del proceso de enriquecimiento.

Para obtener más detalles, consulte nuestra hoja de datos del kit de preparación de bibliotecas de ADNlc aquí: https://www.twistbioscience.com/resources/technical-document/cfdna-library-prep-kit-datasheet

Recomendamos consultar nuestra hoja de datos para determinar la entrada óptima de masa de ADNlc: https://www.twistbioscience.com/resources/technical-document/cfdna-library-prep-kit-datasheet

La cantidad óptima de entrada de ADNlc deberá determinarse ponderando variables, como la sensibilidad deseada en el valor de VAF objetivo, los requisitos de duplexado, el contenido del panel y los recursos de secuenciación disponibles.

La masa de la biblioteca utilizada en el enriquecimiento del objetivo se calcula en función de la entrada de masa de las muestras de ADNlc en la preparación de bibliotecas. Utilice la concentración de cada biblioteca indexada amplificada para calcular el volumen (en μl) de cada biblioteca necesaria para la hibridación al realizar una monoplex u 8-plex. Esta información también puede encontrarse en el apéndice B del protocolo aquí:https://www.twistbioscience.com/resources/protocol/twist-cfdna-target-enrichment-standard-hybridization-protocol

El rendimiento máximo recomendado de la biblioteca en el enriquecimiento del objetivo es de 12,8 μg. When pooling libraries from variable starting mass inputs, each library should have the same input mass added to the pool for uniform sequencing allocation post-capture.

Para calcular dicha masa, multiplique la entrada de masa más alta por 80x. Por ejemplo:

●       With an 8-plex where the highest sample mass input is 20 ng, pool 1,600 ng from each library for a total of 12.8 μg.

●       With an 8-plex where the highest sample mass input is 10 ng, pool 800 ng from each library for a total of 6.4 μg.

El flujo de trabajo del kit de preparación de bibliotecas de ADNlc crea bibliotecas en <3 horas.

La entrada de ADN recomendada es de 1-20 ng de ADNlc suspendido en agua de grado biológico molecular, 10 mM Tris-HCl pH 8,0 o tampón EB. 

Las recomendaciones mínimas para la entrada de masa en el enriquecimiento del objetivo se basan en la entrada de masa en la preparación de bibliotecas de ADNlc únicamente para muestras monoplex (consulte la ecuación). Este es un pase mínimo recomendado a la captura. Se puede tolerar un aumento de la tasa de enriquecimiento del objetivo en hasta 12,8 μg.

El kit de preparación de bibliotecas de ADNlc se envía con hielo seco y debe almacenarse a entre -25 °C y -15 °C tras la recepción.

El kit puede preparar bibliotecas de ADNlc con adaptadores universales para PCR con cebadores UDI y también adaptadores UDI de longitud completa para aplicaciones WGS y sin PCR (consulte el protocolo de UDI de longitud completa de ADNlc aquí:

https://www.twistbioscience.com/resources/protocol/twist-cfdna-library-preparation-kit-twist-full-length-udi-adapters).

Para obtener más información, consulte https://www.twistbioscience.com/products/ngs/library-preparation/universal-adapter-system.

Asimismo, la biología molecular del kit debería funcionar con adaptadores y cebadores de otros distribuidores. However, the adapter must contain a 3’ T overhang to facilitate the A/T ligation with the 3’ A overhang in the library molecules. 

El rendimiento final de la biblioteca podría ser ligeramente inferior cuando no se utiliza la solución optimizada de Twist.

Recomendamos reducir el plexado para evitar superar el límite de 12,8 μg. 

Si se almacena y manipula de acuerdo con las recomendaciones, el producto funcionará perfectamente hasta la fecha de caducidad indicada. The product has been tested with up to eight freeze/thaw cycles, and shown no impact to expected performance.

El kit de preparación de bibliotecas de ADNlc Twist crea bibliotecas indexadas que pueden utilizarse en experimentos de secuenciación del genoma completo (WGS) o posteriormente con los kits de enriquecimiento del objetivo Twist, y secuenciarse en sistemas de secuenciación de última generación (NGS) Ilumina.

El kit de enriquecimiento del objetivo de ADNlc admite una captura híbrida de 1-plex (única) u 8-plex.

Hemos detectado una reducción en el rendimiento en función de las métricas de captura objetivo. Este rendimiento reducido está relacionado con aumentos en los valores fuera de diana. 

También puede producirse sobreamplificación si se usan demasiados ciclos de PCR. Once PCR primers are depleted, library fragments may be single stranded or form heteroduplexes that appear as high molecular weight fragments in capillary gel electrophoresis instruments. Estos picos son diferentes de los picos dinucleosómicos esperados de ADNlc, de acuerdo con lo visto en los primeros ciclos de PCR. We recommend starting with the number of PCR cycles recommended in the protocol (https://www.twistbioscience.com/resources/protocol/twist-cfdna-library-preparation-twist-umi-adapter-system) and reducing PCR cycles if overamplification is observed.

El kit proporciona todos los reactivos necesarios para preparar hasta 960 bibliotecas listas para secuenciador; no obstante, los clientes tendrán que proporcionar el equipamiento de laboratorio y los reactivos habituales, como puntas de pipetas, un soporte magnético y EDTA. Dispone de una lista completa en el protocolo.  

El cliente también es responsable de proporcionar recursos informáticos para la desmultiplexación. Twist proporciona una guía para realizar la desmultiplexación de muestras.

Como el mecanismo de cambio de índice está ligado al cambio de adaptador, no es probable que ello afecte a las bibliotecas de 96-plex, ya que utilizan un código de barras en línea. Además, el paso final de selección del tamaño basado en las microesferas durante la preparación de la biblioteca debería minimizar la presencia de adaptadores sueltos en la biblioteca final.

No en este momento.

Sí, pero la desmultiplexación se debe hacer de forma independiente, una por cada tipo de biblioteca. Vea la guía de desmultiplexación para obtener instrucciones concretas.

En este momento, no es posible comprar cajas y componentes por separado.

Use la concentración de carga recomendada por defecto para la plataforma de secuenciación que usted utilice. Se debería determinar la molaridad usando el análisis de intervalo del principal pico objetivo del Agilent Bioanalyzer. Diluya en función de esa cuantificación, no el modo de tamaño de pico o la estimación de molaridad por defecto.  

El kit de preparación de bibliotecas 96-plex Twist se puede ver en la tienda electrónica de Twist. En la aplicación SARS, busque 104951 o bien 104950; allí encontrará el kit de preparación de bibliotecas 96-plex Twist de 4 x 96 muestras (4300 USD) o de 10 x 96 muestras (9600 USD).

El kit contiene dos placas de cebador para usar durante la reacción “A”. La placa de GC alto incluye cebadores aleatorios ajustados para >50 % de contenido de GC, mientras que la placa de GC bajo incluye cebadores ajustados para <50 % de contenido de GC. Users may optimize their workflow using either of these plates, or combining them in a 1:1 ratio for 40-60% GC. 

El kit está configurado para gestionar hasta 96 muestras en cada lote. Los pocillos vacíos en la placa “A” no se pueden guardar para un lote posterior, por lo que no llenar la placa del todo reduciría su rentabilidad. 

Si desea procesar menos de 96 muestras de una vez, recomendamos llenar el resto de la placa con duplicados de muestras, lo que proporcionaría aún mayor confianza en los resultados de la secuenciación.  

Sí. En este caso, el índice TruSeq i7 de ARN pequeño de 6 nucleótidos de Illumina, que identifica la placa, no se debe leer. No haga una lectura de indexación ni use la opción “--use-bases-mask” (usar máscara de bases) para ignorar la lectura de índice de 6 nt. Esto debería conllevar un único set de archivos FASTQ para el ciclo de secuenciación completo. Vea la guía de desmultiplexación para obtener más información.

Ofrecemos dos configuraciones de tamaño de kit.

La primera es suficiente para hasta 960 muestras; el kit contiene suficientes reacciones para diez placas de 96 pocillos. No hace falta usar todo el kit de una vez, aunque se recomienda usar un mínimo de una placa por ciclo de secuenciación.

Nuestra configuración más reciente es un kit de configuración 4 x 96 que puede procesar 384 muestras. Este kit ofrece el mismo flujo de trabajo y relación coste-beneficio por muestra que el kit de 10 x 96, pero proporciona un volumen de muestras y un precio general menores que pueden ser más adecuados para nuevos clientes que desean probar el producto o para aquellos con proyectos discretos que impliquen menos de 960 muestras. 

Puede encontrar más información sobre el producto en el sitio web de Twist, incluidos enlaces a la hoja de producto, el protocolo y la guía sobre desmultiplexación. 

La cantidad de introducción recomendada es 50 ng, que debería producir unos 200 ng de biblioteca final. Este resultado variará en función de las condiciones de selección del tamaño de las microesferas utilizadas. Se recomienda introducir ADN de alto peso molecular. Recomendamos evitar muestras degradadas, como FFPE, con este kit.

La desmultiplexación de bibliotecas de 96-plex Twist es diferente al proceso estándar. Los distintos códigos de barras de las muestras están en línea como parte de R1, en lugar de en la ubicación estándar i5. Debido a esto, las herramientas bcl2fastq2 y BCLconvert de Illumina no reconocen el código de barras de la muestra individual y, en su lugar, combinan todos los pocillos juntos en un único archivo FASTQ a nivel de placa durante la desmultiplexación, basándose en el índice sencillo i7. 

Para resolver esto, los usuarios de 96-plex deben seguir un proceso de desmultiplexación de dos pasos. Primero, los archivos BCL por ciclo deben convertirse en un FASTQ a nivel de placa y, luego, debe seguir una segunda conversión de los archivos FASTQ a nivel de placa en archivos FASTQ específicos de la muestra. Recomendamos usar el software de código abierto fgbio DemuxFastqs para producir FASTQ por muestra. Vea la guía de desmultiplexación en el sitio web de Twist para obtener más información.

Nuestros kits 96-plex tienen una validez de un año desde el momento de su fabricación. 

El protocolo de preparación de bibliotecas 96-plex está en el sitio web de Twist. 

El kit es compatible con plataformas Illumina. Prepara bibliotecas bicatenarias con adaptadores de secuencia completa de Illumina, previstos para la secuenciación de extremos emparejados o sueltos. En este momento, las bibliotecas finales no son compatibles para su uso con otra tecnología de secuenciación.

Se deben usar las secuencias del adaptador TruSeq para el recorte del adaptador durante la desmultiplexación a nivel de placa de bcl2fastq2/bclconvert de Illumina. La herramienta de desmultiplexación fgbio le permitirá recortar el código de barras en línea en R1 y los aleatorizadores sintéticos en lecturas durante la desmultiplexación a nivel de muestra.

El kit incluye ADN pUC19 con islas CpG metiladas y ADN lambda no metilado. Estos controles pueden utilizarse para determinar la eficiencia de la conversión enzimática durante la preparación de bibliotecas.

NOTA: Los controles internos no deben incluirse en el flujo de trabajo de captura a menos que se añadan sondas específicas de los controles al panel de enriquecimiento.

Sí, se admite la multiplexación hasta un 8 plex. Recomendamos usar 200 ng de biblioteca para un único plex y 1500 ng (o 187,5 ng cada uno) para una captura de 8 plex.

No. La captura híbrida debe realizarse con el sistema de hibridación rápida Twist.

No hay detrimento en ninguna métrica de selección híbrida al usar este reactivo. Reduce los casos fuera de diana de forma variable en función de las regiones objetivo del panel de metilación personalizado y los estados de metilación del ADN genómico suministrado. También puede reducir en un 50 % los casos fuera de diana en algunos paneles personalizados.

Consulte la tabla: 

El rendimiento final esperado de las bibliotecas es de 50-75 ng/ul. Este rendimiento dependerá de la calidad del suministro inicial.

De 350 a 450 pb

Se recomienda un mínimo de 10-20 ng de ADN de alta calidad y un máximo de 200 ng.

De 200 a 300 pb

Twist solo admite la fragmentación mecánica para esta aplicación durante la creación de las bibliotecas para la conversión de metilación.

Lo siguientes pueden modificarse para optimizar una captura híbrida:

• Tiempo de hibridación: empezar con 2 horas según se recomienda y modificar a entre 30 minutos y 4 horas.
• Fast Wash Buffer 1 Temperature – Start with 65°C, adjust between 63–66°C.

Yes; however, increases in library complexity may not be as dramatic as those seen with low input cfDNA.

Sí, los UMI metilados Twist pueden utilizarse como sustitución directa durante el paso de preparación de bibliotecas.

Sí, si se solicita tras la adquisición, el soporte técnico de Twist puede proporcionar las secuencias de UMI. Envíe un correo electrónico a customersupport@twistbioscience.com para obtener ayuda.

Yes, bioinformatic processing steps are outlined in the product sheet.

Cinco bases procesables y 2 bases recortables.

Los adaptadores de UMI metilados Twist están formados por 32 pares discretos de adaptadores con secuencias de UMI en línea, lo que significa que están presentes justo después del sitio de unión del cebador de secuenciación.

Los bloqueadores universales Twist son compatibles con los kits de biblioteca de estilo TruSeq® de Illumina® con esquemas de indexación simple y doble, y varias longitudes de códigos de barras/UMI. Para obtener más información, descargue la hoja de producto de nuestros bloqueadores universales.

Recomendamos una entrada máxima de 4 ug de ADN para la hibridación. Agregar más ADN puede reducir la eficiencia de los bloqueadores, lo que resultaría en lecturas más altas fuera del objetivo.

Las secuencias de los cebadores de amplificación poscaptura del kit de secuenciación de última generación (NGS) son:

Cebador P5: AATGATACGGCGACCACCGA

Cebador P7: CAAGCAGAAGACGGCATACGA

La concentración de nuestros cebadores es de 10 uM para cada cebador. La concentración final del cebador es 0,5 uM en la PCR posterior a la captura.