Las biopsias líquidas son muy prometedoras para reducir la carga de la enfermedad del cáncer en los pacientes. La detección precoz del cáncer a través del ADN circulante libre representa la visión más amplia y requiere una alta especificidad. El seguimiento continuo de la enfermedad es otra aplicación importante de la biopsia líquida y requiere una alta sensibilidad. El desarrollo de pruebas requiere una validación analítica y las pruebas deben monitorizarse para un rendimiento continuo. Estas pruebas exigen materiales de referencia con frecuencias alélicas variantes específicas para la evaluación de la especificidad y la sensibilidad. Anteriormente, la obtención de materiales de referencia era un proceso laborioso de búsqueda o ingeniería de líneas celulares mutantes. Aquí, describimos el diseño, la fabricación y el control de calidad de un estándar de referencia sintético: los estándares de referencia pantumorales de Twist, desarrollados utilizando la plataforma de impresión de ADN patentada de Twist para incluir una amplia selección de objetivos de cáncer tanto comunes como raros para la validación analítica. El material de referencia imita fielmente la distribución de tamaños y el contenido del ADN circulante libre, con un pico principal a 167 pb y un pico secundario a 334 pb. El ADNcl de fondo procede de un único donante y está altamente caracterizado mediante NGS. El estándar de referencia incluye más de 400 sitios de variantes en 84 genes, incluidos sitios de variantes clínicamente pertinentes seleccionados en la bibliografía. Se incluyeron variantes adicionales a nivel de panel para ayudar en la resolución de problemas de los paneles de captura. El ADN variante se imprime sintéticamente a 167 pb ± 5 pb y se coloca en mosaico sobre el sitio con un amplio solapamiento, lo que proporciona una diversidad de extremos de ADN en relación con la posición del sitio de variación. Los sitios de las variantes se imprimieron y cuantificaron de manera independiente para poder agruparlos de manera uniforme. Para garantizar la calidad, se aplican controles de calidad de secuenciación de última generación (NGS) en múltiples pasos. Los productos finales están disponibles en una serie de dilución de frecuencia alélica variante (VAF). El control de calidad de la serie de diluciones se realiza mediante PCR digital de gota (ddPCR) para garantizar la precisión de las frecuencias alélicas de las variantes. Los estándares de referencia pantumorales Twist proporcionan una valiosa solución para los desarrolladores de ensayos basados en secuenciación de última generación (NGS) que buscan materiales de referencia para una amplia gama de variantes del cáncer, con lo que aceleran la adopción de las pruebas de biopsia líquida hacia la práctica clínica rutinaria.