Escuche en este taller cómo nuestros clientes se están beneficiando de la solución optimizada de secuenciación por metilación de Twist con el fin de estudiar los cambios epigenéticos en los humanos. Aprenda cómo han diseñado y optimizado sus flujos de trabajo, vea cómo su epigenética de exploración cambia como predictor de enfermedad y comprenda por qué han elegido soluciones de Twist para su investigación.

La enfermedad mínima/molecular residual (EMR) hace referencia al pequeño número de células tumorales que pueden permanecer en un paciente tras una intervención terapéutica. La detección de estos remanentes y la monitorización de su abundancia es un prometedor marcador pronóstico para identificar individuos en riesgo de recurrencia o que necesitan terapia adyuvante. Debido a la escasa abundancia de ADNtc presente en las muestras obtenidas durante la remisión, los análisis de EMR han de ser muy sensibles. Además, cada individuo tendrá un conjunto diferente de variantes somáticas, lo que requerirá soluciones personalizadas para su detección. Por lo tanto, para diagnosticar la MRD, se precisan análisis de NGS personalizados con alta sensibilidad y especificidad. Para responder a esta necesidad y favorecer las evaluaciones precisas de la MRD, Twist Bioscience ha desarrollado los paneles MRD Rapid 500. Este producto permite a los clientes diseñar, fabricar y enviar paneles MRD totalmente personalizados (hasta 500 objetivos) en tan solo seis días. Para demostrar la sensibilidad de detección de los paneles MRD Rapid 500 de Twist, hemos diseñado cinco paneles MRD personalizados que se dirigen específicamente a variantes somáticas presentes en el cáncer de mama, de pulmón y colorrectal, y en el melanoma y el carcinoma de células renales. Cada uno de estos paneles MRD se ha diseñado para incluir 197 objetivos, con entre 3 y 5 variantes por tejido de origen y una selección de mutaciones pasajeras. Las secuencias de sondas de cada panel se han diseñado para incorporar el alelo variante en el conjunto de muestras de prueba. Para crear el conjunto de muestras, hemos mezclado secuencias de variantes sintéticas con ADNg fragmentado de línea celular (NA12878) para formar una muestra artificial que se aproxima al perfil de ADN tumoral circulante y libre circulante. Se han creado cinco niveles de frecuencia con frecuencias alélicas variantes (FAV) medias del 0 % (WT), 0,01 %, 0,05 %, 0,1 % y 2 %. Libraries were prepared with UMI adapters and target enrichment was performed using the MRD panels.    With a sequencing depth of 80,000x, variant calling results revealed that an average of 20 SNV targets can be detected with confidence in the 0.01% VAF samples for each MRD panel, clearly distinguishable from the WT control samples. Además de demostrar la precisión de la llamada de variantes al tener como objetivo al alelo alternativo, mostramos la utilidad de dirigirse a un gran número de variantes para la detección de una firma MRD a niveles muy bajos (por ejemplo, FAV del 0,01 %).   En resumen, el comportamiento de los paneles MRD Rapid 500 Twist mostró una alta sensibilidad en la detección de mutaciones somáticas de frecuencia ultrabaja.

Introduction DNA methylation at CpG nucleotide sites in eukaryotes is a key epigenetic mark that helps regulate gene expression. En muchos cánceres humanos, se producen cambios específicos en la metilación en CpG, lo que los convierte en un biomarcador prometedor para la detección precoz del cáncer. Sin embargo, los análisis existentes pueden ser costosos y carecer de especificidad para las regiones de interés, y, a menudo, solo proporcionan cálculos semicuantitativos de la fracción de metilación. Aquí, presentamos nuevas herramientas para enfrentarse a estos desafíos, incluido el uso del panel de metiloma dirigido para reducir los costes asociados a la secuenciación de última generación (NGS), los controles de metilación para calibrar análisis cuantitativos e identificadores moleculares únicos (UMI) para una deduplicación precisa en muestras de baja diversidad. Experimental Procedures Genomic DNA (gDNA) was prepared for sequencing using the Twist Methylation Detection System consisting of enzymatic methyl conversion library generation and hybrid capture using the Twist Human Methylome Panel. Se añadieron controles específicos de metilación en CpG Twist al ADNg con diferentes tasas de metilación antes de la preparación de bibliotecas, y se pasó por el sistema de detección de metilación por NGS Twist con paneles homólogos, para demostrar cómo se pueden utilizar estos controles para calibrar los análisis de detección. Asimismo, se generaron bibliotecas utilizando ADN circulante libre de células (ADNlc) y adaptadores convencionales o con UMI durante el paso de unión de la preparación de bibliotecas, para investigar el impacto de la detección cuantitativa y la cobertura única total. Data Using the Twist Human Methylome Panel at 150x raw coverage achieves uniform coverage with low off-bait Picard metrics. Se detectaron 6,59 millones de sitios de CpG con una profundidad mínima de 10x. La captura dirigida con el panel de metiloma humano permite una tipificación de CpG informativa de hasta 82 muestras en una única celda de flujo Illumina Novaseq S4. Por el contrario, si se realiza una secuenciación con bisulfito del genoma completo (WGBS) tradicional sin enriquecimiento del objetivo, solo podrán procesarse 3 muestras en la misma celda de flujo. Los controles específicos de metilación en CpG Twist están formados por 48 secuencias artificiales únicas que contienen un total de 8 niveles diferentes de metilación, desde el 100 % hasta el 0 %. La inclusión de estos controles permite la cuantificación de los niveles de metilación en la cualificación de muestras experimentales del proceso de conversión enzimática. Conclusions Our study uses several new products found in the Twist methylation detection portfolio that interrogate genome-wide methylation patterns for various applications. No solo hemos encontrado formas de controlar mejor los análisis, sino que también hemos determinado métodos que representan costes más bajos en comparación con los estudios WGBS.