Los avances en la secuenciación de última generación (NGS) siguen reduciendo los costes de secuenciación aumentando los datos generados por ciclo. Esta reducción en los costes de secuenciación permite que los experimentos genómicos para la población ayuden a estudiar y diagnosticar los trastornos genéticos. A pesar de los avances del secuenciador, la preparación eficiente de bibliotecas de secuenciación de última generación (NGS) se ve dificultada por el coste y los esfuerzos necesarios para procesar muestras individuales. Las bibliotecas deben cuantificarse y agruparse para distribuir de forma equitativa las lecturas de secuenciación, lo que es algo terriblemente tedioso y costoso a medida que el número de muestras aumenta, Presentamos una tecnología de preparación de bibliotecas de secuenciación de última generación (NGS) que elimina la necesidad de normalización de la manipulación muestra a muestra y agrupa muestras en una fase temprana del proceso, lo que conlleva una gran simplificación del flujo de trabajo y un aumento de 48 veces el rendimiento del procesamiento de muestras posterior a la ligadura sin comprometer la calidad de los datos. Este flujo de trabajo de alto rendimiento se basa en la fragmentación enzimática de las muestras convertidas en bibliotecas secuenciables mediante nuevos adaptadores de normalización con códigos de barras en línea. La normalización de bibliotecas ocurre a partir de adaptadores durante el paso de ligadura y consigue una conversión de biblioteca independiente de la masa de entrada de ADN (20-200 ng, CV <20 %) a la par con el agrupamiento basado en qPCR. Se incluyen hasta 48 códigos de barras en los adaptadores, que se ligan de manera uniforme a las muestras para una desmultiplexación sencilla. El diseño de los códigos de barras en línea permite una agrupación flexible en la que se pueden agrupar hasta 48 muestras de forma modular. Con adaptadores de normalización y códigos de barras en línea, la agrupación se realiza inmediatamente después de la ligadura del adaptador, lo que reduce significativamente el número de reacciones de limpieza y PCR. Este formato también puede admitir hasta decenas de miles de bibliotecas en un único ciclo de secuenciación mediante cebadores de secuenciación de índice único doble posterior a la ligadura. Finally, multiplexed PCR amplification artifacts can be reduced using this workflow. La conversión de la biblioteca es coherente y está bien adaptada para la secuenciación del genoma completo (SGC) de pase bajo y la secuenciación objetivo para la llamada de variantes (cobertura >20x). Este nuevo proceso de preparación de bibliotecas aplica una nueva tecnología para reducir el tiempo de manipulación manual y aumentar la eficiencia. Un proceso que, ahora, una vez tratada cada muestra individualmente, puede agruparse al tiempo que se garantiza una conversión igual independiente de la entrada de masa de ADN. Este flujo de trabajo avanza significativamente el proceso experimental de preparación de bibliotecas para complementar los avances en rendimiento realizados en la instrumentación de secuenciación.