La maladie résiduelle minime/moléculaire (MRD) désigne un petit nombre de cellules tumorales qui peuvent subsister chez un patient après une intervention thérapeutique. La détection de ces résidus et le suivi de leur nombre constituent un marqueur pronostique prometteur pour identifier les individus présentant un risque de récidive ou nécessitant une thérapie adjuvante. En raison du faible taux d’ADNc présent dans les échantillons obtenus pendant la rémission, la sensibilité des analyses MRD doit être élevée. En outre, chaque individu présentant un ensemble différent de variants somatiques, des solutions personnalisées de détection sont nécessaires. Ainsi, des analyses NGS personnalisées avec une sensibilité et une spécificité élevées sont requises pour le diagnostic MRD. Afin de répondre à ce besoin et évaluer précisément la MRD, Twist a mis au point les panels MRD Rapid 500. Ce produit permet aux clients de concevoir, de fabriquer et d’expédier des panels MRD entièrement personnalisés (jusqu’à 500 cibles) en six jours seulement. Afin de démontrer la sensibilité de détection des panels Rapid 500 MRD de Twist, nous avons conçu cinq panels MRD personnalisés qui ciblent spécifiquement les variants somatiques trouvés dans les cancers du sein, du poumon, du col de l’utérus, du mélanome et du carcinome à cellules rénales. Chacun de ces panels MRD a été conçu pour inclure 197 cibles, avec 3 à 5 variants par origine tissulaire et une sélection de mutations passagères. Les séquences de sondes de chaque panel ont été conçues pour incorporer l’allèle variant dans l’ensemble d’échantillons testés. Pour créer l’ensemble d’échantillons, nous avons mélangé des séquences de variants synthétiques avec de l’ADNg fragmenté de la lignée cellulaire (NA12878) pour former un spécimen artificiel qui se rapproche du profil de l’ADN tumoral acellulaire circulant. Cinq niveaux de fréquence ont été créés avec des fréquences moyennes d’allèles variants (VAF) de 0 % (WT), 0,01 %, 0,05 %, 0,1 % et 2 %. Libraries were prepared with UMI adapters and target enrichment was performed using the MRD panels.    With a sequencing depth of 80,000x, variant calling results revealed that an average of 20 SNV targets can be detected with confidence in the 0.01% VAF samples for each MRD panel, clearly distinguishable from the WT control samples. En plus de démontrer la précision de l’appel de variants en ciblant l’allèle alternatif, nous montrons l’utilité de cibler un grand nombre de variants pour la détection d’une signature de MRD à des niveaux très bas (par exemple, 0,01 % de VAF).   En résumé, les panels MRD Rapid 500 de Twist ont montré une détection à haute sensibilité de mutations somatiques à très basse fréquence.

Introduction DNA methylation at CpG nucleotide sites in eukaryotes is a key epigenetic mark that helps regulate gene expression. Des changements spécifiques dans la méthylation des CpG se produisent dans de nombreux cancers humains, ce qui en fait un biomarqueur prometteur pour la détection précoce du cancer. Cependant, les analyses existantes peuvent être coûteuses, manquer de spécificité pour les régions d’intérêt et ne délivrent souvent que des estimations semi-quantitatives de la fraction de méthylation. Nous présentons ici de nouveaux outils pour relever ces défis, notamment l’utilisation d’un panel de méthylomes ciblés pour réduire les coûts associés au séquençage de nouvelle génération (NGS), des contrôles de méthylation pour calibrer les analyses quantitatives et des UMI pour une déduplication précise dans les échantillons peu diversifiés. Experimental Procedures Genomic DNA (gDNA) was prepared for sequencing using the Twist Methylation Detection System consisting of enzymatic methyl conversion library generation and hybrid capture using the Twist Human Methylome Panel. Des contrôles spécifiques de la méthylation des CpG Twist ont été ajoutés à l’ADNg avec différents taux de méthylation avant la préparation de banques et ont été soumis au Twist NGS Methylation Detection System à l’aide de panels homologues afin de démontrer comment ces contrôles peuvent être utilisés pour calibrer les analyses de détection. En outre, des banques ont été générées à partir d’ADN acellulaire (cfDNA) et d’adaptateurs conventionnels ou contenant des UMI lors de l’étape de ligature de la préparation de banque afin d’étudier l’impact sur la détection quantitative et la couverture unique totale. Data Using the Twist Human Methylome Panel at 150x raw coverage achieves uniform coverage with low off-bait Picard metrics. 6,59 millions de sites CpG ont été détectés en utilisant une profondeur minimale de 10x. La capture de cibles avec le panel de méthylome humain permet d’obtenir des informations sur les CpG pour un maximum de 82 échantillons sur une seule cellule Illumina Novaseq S4. En revanche, lors d’un séquençage après conversion au bisulfite du génome entier (WGBS) traditionnel sans enrichissement ciblé, seuls 3 échantillons peuvent être analysés sur la même cellule. Les contrôles spécifiques de la méthylation des CpG Twist sont constitués de 48 séquences artificielles uniques qui contiennent un total de 8 niveaux de méthylation différents, allant de 100 % à 0 %. L’inclusion de ces contrôles permet de quantifier les niveaux de méthylation dans la qualification des échantillons expérimentaux du processus de conversion enzymatique. Conclusions Our study uses several new products found in the Twist methylation detection portfolio that interrogate genome-wide methylation patterns for various applications. Nous avons non seulement trouvé des moyens de mieux contrôler les analyses, mais nous avons également déterminé des méthodes permettant de tenir compte des coûts inférieurs à ceux du WGBS. 

Nous avons étudié les différences génétiques produites par un programme de sélection à long terme en créant un croisement F2 entre deux lignées de rats exogames phénotypiquement divergentes, puis nous avons utilisé ce croisement F2 pour cartographier les loci relatifs au trait de sélection, au comportement de recherche de sensations, ainsi qu’à plusieurs traits supposés corrélés.