Multiplexed Gene Fragments

There are no complexity requirements for MGF. ただし、含まれる配列によっては以下のように最適な結果が得られない場合があります。

1. すべての配列の間でダイレクトリピートや共通配列があると、PCRを使った増幅中に何らかの組換えが生じる場合があります。
2. 長いホモポリマー（> 20 bp）は、増幅中のドロップアウトの発生につながる場合があります。
3. ヘアピンが強いと増幅が不十分になり、その結果、それらの配列が少なく含まれたりドロップアウトにつながる場合があります。

いいえ、プール内のすべての断片が同じフランキング配列を両端に持つ必要があります。フランキング配列が異なるプールが必要な場合には、複数のプール製品に分けてご発注ください。あるいは、 Twist が増幅に用いる汎用的な外側のフランキング配列と、その内側に異なるフランキング配列を配置したプールを設計することもできます。内側のフランキング配列を利用してサブプールを増幅することもできますが、均一性に歪みが生じたり、鋳型鎖が不足したりするという特有のリスクが生じます。

いいえ。Twist では、A、C、G、T の 4 つの標準塩基を含む配列しか合成できません。混合塩基（R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、N）を使用することはできません。ただし、遺伝子断片の特定の位置に 4 種類すべての塩基（すなわち塩基のサブセット）を配置したい場合は、目的の部位にそれぞれ異なる塩基を配置した別々の断片を設計することができます。

はい。制限酵素を用いたクローニングにご使用頂ける、 Twist の標準フランキング配列がございます。

ステップ 1：MGF Submission Form をダウンロードし、設計いただいた内容を漏れなくご記入ください。

ステップ 2：記入済みのフォームをこちらからアップロードします。

ご不明点、システムトラブルがございましたら、メール（customersupport@twistbioscience.com）やチャットでお問い合わせください。

固定フランキング配列（プライマー）設計では以下の標準ルールを考慮してください。

1. 長さ20 ～ 25bp
2. 35 ～ 70% のG/C含有量
3. 融解温度（Tm）55 ～ 60 °C
4. プライマーペアは互いの Tm が 5 °C 以内であること
5. プライマーペアは相補的領域を持たないこと
6. 可変領域の内部にプライマー結合部位を設けないこと

1. 断片長は 301 ～ 500 塩基（固定フランキング配列を含む）です。
2. 断片の全長は、 PCR に用いる固定フランキング配列を含めて 500 塩基を超えることはできません。フランク配列の鎖長は20 ～ 25 bp 必要なため、ご使用頂ける鎖長は最大 460 bp となります。
3. 最短の配列と最長の配列の鎖長の違いは 80 bp 以内にしてください（例えば、最長の配列が 400 bp であれば、最短の配列は 320 bp 以上である必要があります）。

Multiplexed Gene Fragments の納期は 8 ～ 12 営業日です。

価格は配列の多様性（プールサイズ）と断片長（301 ～ 350 塩基、351 ～ 400 塩基、401 ～ 450 塩基、451 ～ 500 塩基）の組合せで決まります。

1. 最終プールに対してキャピラリー電気泳動を行い、サンプルの純度を確認します。プール内の分子の少なくとも 90% が、設計した鎖長の範囲内に収まることを確認します。
2. 最終サンプルに対して蛍光を用いた定量分析を行い、 200 ng 以上の核酸が含まれることを保証します。
3. Twist はプールについてシーケンシングは行わず、各配列の含有量やエラー率などはQC基準に含めていません。ただし、ほとんどプールで 90/10パーセンタイル比が 3 未満、平均エラー率が約 1 : 2,000 である製造条件を採用しています。

Twist では合成にホスホロアミダイト法を使用しています。従来のカラムを用いた合成法に比べて、当社の合成プラットフォームは合成プロセスを小型化し、反応体積を減らしながらスループットを向上させています。このプロセスは何年もかけて最適化され、現在 Twist では最長 500 ヌクレオチドのプールをプリントできるようになりました。合成後、最適化された増幅ワークフローにしたがって、二本鎖 DNA の形でMultiplexed Gene Fragments が生成されます。

Twist Multiplexed Gene Fragments (MGF) は、最大数十万もの二本鎖 DNA 断片（長さ 301 ～ 500 塩基対）を独自のプール形式で提供するものです。このように断片がプールされた形式のため、プライム編集、CRISPR をベースとした極めて複雑な機能スクリーニング、ペプチドおよびタンパク質工学、抗体探索、超並列レポーターアッセイ（MPRA）などのハイスループットスクリーニングアプリケーションが可能になります。これらのアプリケーションでは、断片 1 本あたりのコストが、目的とするバリアント数に対して障害となる場合があります。

Twist は、最適化された増幅ワークフローを用いて、二本鎖 DNA の形で Multiplexed Gene Fragments を合成しています。これにより、合成された材料の PCR 増幅の難易度が非常に高くなりうる場合に、増幅結果が不良となるリスクを軽減します。

Multiplexed Gene Fragments は、増幅した二本鎖 DNA であり、1 本のチューブにプールした凍結乾燥品としてお届けします。

1. 未修飾の Multiplexed Gene Fragments は安定です。DNA を長期間保管する場合、1 年以内の場合は −20 °C で保管し、さらに長期間保管する場合は −80 °C で保管してください。
2. 断片を溶液中で保管する場合、凍結と融解の繰り返しは断片の物理的劣化につながりますので避けてください。
3. 多くの実験を予定している場合、サンプルをあらかじめ分注し、それぞれ－20 ℃ で保管するようにしてください。
4. ヌクレアーゼや細菌の汚染を防ぐため、取り扱いには十分ご注意ください。

再懸濁ガイドライン：

• 再懸濁させる場合は、開封前にチューブを軽く遠心分離機にかけ、ヌクレアーゼフリーの Tris-EDTA（TE）バッファー（pH8.0）または 10 mM Tris-HCl（pH8.0）で目的の濃度に再懸濁させます。
• ストック溶液（希釈液）の濃度は 10 ng/μL 以上を推奨しますが、ご使用のアプリケーションに応じて適切に設定ください。
• ストック溶液とは別に必要量ずつ分注して保存すると、コンタミネーションを防ぎ、凍結・融解のサイクルを減らすことができます。分注液は速やかに使用し、高温に長くさらさないようにご注意ください。

再懸濁させた DNA

• Twist は、再懸濁させた DNA については保管条件に応じて以下の期間内にお使いいただくことを推奨します。
  • 室温：3 ヶ月
  • 4 °Cで 12 ヵ月
  • −20 °C ： 24 ヶ月
  • −80 °C ：長期保存

Twist Bioscience ships Multiplexed Gene Fragments dried down in tubes at ambient temperature. 二本鎖 DNA は、多くのラボにおける標準的な保管条件で安定です。しかし、Twist Bioscience で合成された DNA の品質を高い状態に保つには、以下のような保存条件を推奨しています。

• Twist では、乾燥 DNA の保存期間について、保存条件に応じて以下の期間を推奨しています。
  • 室温：3 ヶ月
  • 4 °Cで 12 ヵ月
  • −20 °C ： 24 ヶ月
  • −80 °C ：長期保存