cfDNA Pan-cancer

456 種類のバリアントすべてが 1 本のチューブに入っています。

Twist cfDNA コントロールは二重鎖 DNA です。それらは、それぞれが特定の VAF レベルを持つように Twist の技術で設計・合成され、バックグラウンド cfDNA にスパイクインされた合成「ctDNA」分子の混合物です。

このスタンダードには、1 bp 〜 30 bp の構造多型やインデルなど検出の難しい変異が多く含まれています。それぞれの変異の検出は、お客様が使用しているアライナーやアライメント設定に左右されることがあります。そうした検出の難しい変異は、ご自身のパイプラインを使用している、経験豊富なお客様向けです。その点をご理解ください。SNV や小さな INDEL（例：5 bp 以下）は、より簡単に検出することができます。

Twist バックグラウンド cfDNA は、高忠実度・非増幅 DNA であり、 Twist 独自の断片化プロセスから得られたもので、他社製品と比べて、変異率が極めて低くなっています。

インデックスを用いてライブラリに調製した後は、このコントロールを実検体とプールして同時にシーケンシングを行っても問題ありません。

Twistは、バックグラウンドcfDNAの全エクソームシーケンスを行っています。また、中間VAFのddPCRと、5％バリアント製品のターゲットキャプチャーを行なっています。

臨床的に重要な（すなわち実用的な）がん関連バリアントの厳選リストを作成するために、 Twist は文献検索を行うと共に、COSMIC データベースを参照しました。このリストには、成人の固形腫瘍における多くの主要なバリアントが含まれています。85 種類のユニーク遺伝子に対して 456 種類のバリアントが搭載されています。Twist はまた、臨床的に重要な一連のバリアント（140 種類を超えるバリアント）にそれぞれアノテーションしています。

バリアントの構成とそれらの正確な参照配列・代替配列は、 Twist のウェブサイトに掲載しています。

Twist は、バリアントアレル頻度（VAF）0% および 5% でターゲットエンリッチメント NGS を実施し、0% の場合はすべてのバリアント部位でバリアントが検出されないよう、5% の場合は検出されるよう確保しています。加えて、6 つの部位について、すべての種類の VAF レベルで ddPCR を用いて確認を行っています。

Twist cfDNA は不死化細胞株を由来としていますので、遺伝子型とパフォーマンスがロット間で一貫した大量生産が可能となっています。

Twist は、10 mM Tris pH 8、0.1 mM EDTA の「Low-EDTA TE」の使用を推奨します。下流ステップとの兼ね合いから EDTA を避けなければならない場合は、Qiagen Elution Buffer（10 mM Tris-HCl、pH 8）を使用できます。

この欠失は T が 10 個連続するゲノムコンテクストで、ATM 遺伝子 に起こります。これらの T の連続が遺伝子座を「滑りやすい」配列にし、ゲノムのコピーを複製している DNA ポリメラーゼが、合成中の鎖に対して鋳型鎖を滑らせ、それがインデルの発生につながります。

PCR ポリメラーゼがライブラリ調製 PCR 中に配列をコピーする際に、同じ効果が同じメカニズムで発生する可能性が高いです。すなわち、この遺伝子座は、通常のライブラリ調製時の PCR サイクルのため、自然にバリアント配列を形成する可能性が特に高いといえます。

アレルが全く存在しない場合、ヒトゲノムサンプル（Pan-cancer Reference Standard を含む）では、 PCR エラーにより、この変異の VAF が増加します（汎がんの VAF が 0% の場合、このリファレンススタンダードにおいて、他のバリアント部位の 99.8% よりも高い VAF となります）。したがって、そのゲノムコンテクストのためにバックグラウンドノイズがより高くなり、すなわち配列コンテクストによって、このバリアントのブランク上限（Limit of Blank）が他の遺伝子座よりも高くなり得ることを意味します。

アレルが存在する場合は、真のアレル頻度が遺伝子座のノイズレベルに「加えて」追加され、それはこのバリアントが、他のバリアント部位よりも高い検出限界を持ち得ることを意味します。

UMI アダプター（例： Twist UMI アダプター）を用いてコンセンサス配列やデュプレックス配列を生成させることで、ライブラリ調製時の PCR エラーによるこの遺伝子座のノイズを減少させることができます。

456 種類の変異はすべて NGS で（VAF 0%、5% の両方について）確認しています。0.1%、0.25%、0.5%、1%、2% は 0% と 5% のストックを混合して調製したものです。当社では、ddPCR 用に 0% 〜 5% の VAF にわたる 代表的で関連性のある6 種類のバリアントのセットを選択し、それぞれの含有量や連続的な希釈について記載しました。

完全キットは VAF が 0% ～ 5% の 7 種類（それぞれ 300 ng）で構成されています。3 μg と記載のある製品は、チューブ 1 本で構成されています。600 ng と記載のある製品は、1 本あたり 300 ng のチューブ 2 本で構成されています。

Twist は最初のインプット量として 30 ng を推奨します。リキッドバイオプシーアッセイには 20 〜 30 ng が通常の範囲です。

バリアント断片は、平滑末端の二本鎖 DNA 分子です。

Twist は、この物質が非断片化エンドリペア・ポリ A 鎖付加（ERAT）ライブラリ調製プロトコルや、ddPCR、 qPCR などのアンプリコンプロトコルにおいて適切な基準となるかどうかの試験を行いました。v2 Pan-cancer Reference Standard のパフォーマンスは、v1 や、ライブラリ調製に用いるその他のどのような二本鎖 DNA インプットとも同程度です。

Twist の野生型バックグラウンド cfDNA 模倣体は細胞株由来であり、シャープなモノヌクレオソームのピークと二次的なジヌクレオソームのピークで特徴付けられる、自然に発生する cfDNA の断片化プロファイルを正確に模倣するよう、 Twist 独自の方法で処理しています。

無細胞 DNA は、非常に特異的な生物学的プロセスで生成され、特徴的な断片長プロファイルが得られます。したがって、サイズに関するプロファイルを一切変更しないライブラリ調製、すなわち断片化処理を追加しない Twist 物理的断片化ライブラリ調製キットを使用します。この手法を用いると、ライブラリのインサートサイズが見違えるようになります。Twist では、 Twist UMI アダプターを cfDNA サンプルに広範に使用しており、デュプレックスコンセンサスや、変異率の評価に非常に役立ちます。