Synthetic Controls

当社の mpox ウイルスコントロールは ISO 認証を受けていません。公衆衛生上の必要性に迅速に対応するため、ISO 認証を受けずに本コントロールを発売することにしました。しかし、これらの製品に ISO 認証を受けることも検討しています。ISO 認証についてご関心をお持ちの場合はぜひご連絡ください。

Twist は、mpox、呼吸器疾患（コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、エンテロウイルスなど）、リキッドバイオプシー、がんに対するカスタムコントロールやリファレンススタンダードなど、一連の研究用ツールや NGS 製品をご用意しています。

当社ラインナップに含まれるパネルやコントロールなどにご要望の製品がない場合、営業担当者またはカスタマーサポート（{{[email protected]}}）までお問い合わせください。ご要望に合わせたカスタマイズ製品をご用意できるかどうか検討させていただきます。

The Twist Synthetic human mpox controls have a concentration within 50% to 200% of the targeted 100,000 copies/µl as determined by ddPCR (T1 assay), or between 50,000 to 200,000 copies/µL.

The Certificate of Analysis document reports out at least 100,000 copies/µL fragments concentration with a range of 25% to 400%, or 25,000 - 400,000 copies/µL per fragment.

mpox コントロールの容量は 100 µL で、濃度は約 100,000 コピー/µL です。

mpox の配列はご要望に応じてご提供いたします。お問い合わせ先：customersupport@twistbioscience.com

• Twist Synthetic hMPXV Control 1 (EPI_ISL_13056236) 106051（構成品）／106056（製品）
• Twist Synthetic hMPXV Control 2 (NCBI:ON585037) 106055（構成品）／106059（製品）

各コントロールは mpox ウイルスゲノムの 80 ～ 85% をカバーしています。

サル痘ウイルスコントロールは、凍結状態で、ドライアイス付きで出荷されます。推奨保管温度は－80 °C ですが、短期間であれば－20 °C で保管できます。

mpox コントロールは検証済みで、CDC プロトコルに適合しています。CDC プロトコルにつきましてはこちらをご覧ください。

We recommend starting with 1 µL per reaction and adjusting usage based on the results.

サル痘ウイルスコントロールには、Congo Basin Clade (Control 1) and West Africa Clade (Control 2).

Control 1 contains 154 fragments, while Control 2 contains 151 fragments.

Each of the fragments is around 1.8kb.

mpox コントロールは二本鎖 DNA コントロールであるため、米国外から購入する場合は、バイオセキュリティの観点から輸出許可が必要となります。米国内への出荷の場合、輸出許可は必要ありませんが、 NGS 担当営業にお問い合わせいただきますと見積書を発行しますので、その上でご注文ください。米国外にお住まいの方は、 Twist のカスタマーサポート（customersupport@twistbioscience.com)までご連絡いただき、お客様のお名前、機関名、住所をお知らせください。当社カスタマーサポートチームが、輸出許可が下りるようお客様と連携して対応いたします。

Repetitive sequences, areas of extremely high or low GC content, and homopolymers are excluded in the genome. It is challenging to target those regions.

Twist の SARS-CoV-2 RNA コントロールとパネルは、研究専用です。

The buffer used in SARS-CoV-2 RNA controls is 10 mM Tris-HCl and 0.1 mM EDTA with pH 8.0.

RNA コントロールの保存可能期間は、製造日から 24 ヵ月です。

456 種類のバリアントすべてが 1 本のチューブに入っています。

Twist cfDNA コントロールは二重鎖 DNA です。They are a mixture of synthetic “ctDNA” molecules designed and printed with Twist technology and spiked into the background cfDNA to form each specific VAF (variant allele frequency) level.

このスタンダードには、1 bp 〜 30 bp の構造多型やインデルなど検出の難しい変異が多く含まれています。それぞれの変異の検出は、お客様が使用しているアライナーやアライメント設定に左右されることがあります。These hard-to-detect variants are intended for experienced customers with their own analysis pipeline. SNV や小さな INDEL（例：5 bp 以下）は、より簡単に検出することができます。

The Twist background cfDNA high-fidelity non-amplified DNA is derived from our proprietary fragmentation process, and we have observed an extremely low mutation rate compared to competitor material.

インデックスを用いてライブラリに調製した後は、このコントロールを実検体とプールして同時にシーケンシングを行っても問題ありません。

Twist performs whole exome sequencing for the background cfDNA and utilizes a target capture on the 5% material, in addition to a ddPCR on the intermediate VAFs.

Twist performed a literature search to arrive at a list of curated, clinically-relevant (i.e. actionable) cancer-associated variants, as well as using the COSMIC database as a reference, where matching entries are available.  It includes the many prevalent variants in adult solid tumors. 85 種類のユニーク遺伝子に対して 456 種類のバリアントが搭載されています。Twist also separately annotates the set of clinically relevant variants (>140 of variants).

バリアントの構成とそれらの正確な参照配列・代替配列は、 Twist のウェブサイトに掲載しています。

Twist は、バリアントアレル頻度（VAF）0% および 5% でターゲットエンリッチメント NGS を実施し、0% の場合はすべてのバリアント部位でバリアントが検出されないよう、5% の場合は検出されるよう確保しています。加えて、6 つの部位について、すべての種類の VAF レベルで ddPCR を用いて確認を行っています。

The Twist cfDNA is sourced from an immortalized cell line, which enables us to create large production lots with consistent lot to lot genotypes and performance.

Twist は、10 mM Tris pH 8、0.1 mM EDTA の「Low-EDTA TE」の使用を推奨します。下流ステップとの兼ね合いから EDTA を避けなければならない場合は、Qiagen Elution Buffer（10 mM Tris-HCl、pH 8）を使用できます。

この欠失は T が 10 個連続するゲノムコンテクストで、ATM 遺伝子 に起こります。These consecutive Ts make the locus a "slippery" sequence, where the DNA polymerase replicating a copy of the genome can have the template strand slip relative to the strand being synthesized, leading to an INDEL.

The same effect has a high likelihood of occurring by the same mechanism when a PCR polymerase copies the sequence during library prep PCR. すなわち、この遺伝子座は、通常のライブラリ調製時の PCR サイクルのため、自然にバリアント配列を形成する可能性が特に高いといえます。

アレルが全く存在しない場合、ヒトゲノムサンプル（Pan-cancer Reference Standard を含む）では、 PCR エラーにより、この変異の VAF が増加します（汎がんの VAF が 0% の場合、このリファレンススタンダードにおいて、他のバリアント部位の 99.8% よりも高い VAF となります）。Thus, the background noise is higher due to the genomic context, meaning the Limit of Blank (LoB) of this variant is likely higher than other loci due to the sequence context.

アレルが存在する場合は、真のアレル頻度が遺伝子座のノイズレベルに「加えて」追加され、それはこのバリアントが、他のバリアント部位よりも高い検出限界を持ち得ることを意味します。

UMI アダプター（例： Twist UMI アダプター）を用いてコンセンサス配列やデュプレックス配列を生成させることで、ライブラリ調製時の PCR エラーによるこの遺伝子座のノイズを減少させることができます。

456 種類の変異はすべて NGS で（VAF 0%、5% の両方について）確認しています。0.1%、0.25%、0.5%、1%、2% は 0% と 5% のストックを混合して調製したものです。We selected a set of six representative and relevant variants across 0% to 5% VAFs for ddPCR, showing quantitative formulations and a continuous serial dilution.

完全キットは VAF が 0% ～ 5% の 7 種類（それぞれ 300 ng）で構成されています。3 μg と記載のある製品は、チューブ 1 本で構成されています。600 ng と記載のある製品は、1 本あたり 300 ng のチューブ 2 本で構成されています。

Twist は最初のインプット量として 30 ng を推奨します。リキッドバイオプシーアッセイには 20 〜 30 ng が通常の範囲です。

バリアント断片は、平滑末端の二本鎖 DNA 分子です。

Twist は、この物質が非断片化エンドリペア・ポリ A 鎖付加（ERAT）ライブラリ調製プロトコルや、ddPCR、 qPCR などのアンプリコンプロトコルにおいて適切な基準となるかどうかの試験を行いました。v2 Pan-cancer Reference Standard のパフォーマンスは、v1 や、ライブラリ調製に用いるその他のどのような二本鎖 DNA インプットとも同程度です。

Twist の野生型バックグラウンド cfDNA 模倣体は細胞株由来であり、シャープなモノヌクレオソームのピークと二次的なジヌクレオソームのピークで特徴付けられる、自然に発生する cfDNA の断片化プロファイルを正確に模倣するよう、 Twist 独自の方法で処理しています。

無細胞 DNA は、非常に特異的な生物学的プロセスで生成され、特徴的な断片長プロファイルが得られます。したがって、サイズに関するプロファイルを一切変更しないライブラリ調製、すなわち断片化処理を追加しない Twist 物理的断片化ライブラリ調製キットを使用します。この手法を用いると、ライブラリのインサートサイズが見違えるようになります。Twist では、 Twist UMI アダプターを cfDNA サンプルに広範に使用しており、デュプレックスコンセンサスや、変異率の評価に非常に役立ちます。