はじめに
真核生物における CpG サイトの DNAメチル化は、遺伝子発現の制御に特に有用な、エピジェネティックな目印です。CpG メチル化において、特定の変化がヒトの多くの種類のがんで生じており、がんを早期に検出するための有望なバイオマーカーとなっています。しかし、既存のアッセイはコストが高く、関心領域に対する特異性に欠ける場合があり、メチル化分画の半定量的な推定値しか得られないこともあります。本ポスターでは、 NGS 関連コストを削減するためのターゲット・メチロームパネルの使用、定量アッセイの較正に用いるメチル化コントロール、低多様性サンプルにおける正確な重複排除のための UMI など、そうした課題に対処するための新しいツールをご紹介します。

実験方法
シーケンシングに用いるゲノム DNA (gDNA) を、 Twist Human Methylome Panel を用いた酵素的メチル基変換ライブラリ作製およびハイブリッドキャプチャで構成される Twist NGSメチル化検出システムを用いて調製しました。CpG メチル化の検出に使用できる Twist の特定のコントロールを、検出アッセイの較正にどのように用いることができるかを示すために、ライブラリ調製前にそれらのコントロールをさまざまなメチル化率を持つ gDNA にスパイクインし、 Twist NGSメチル化検出システムで相同パネルを用いて処理しました。さらに、定量的検出と全ユニークカバレッジへの影響を調べるために、ライブラリ調製におけるライゲーションステップでセルフリー DNA (cfDNA) および従来のアダプターまたは UMI を含むアダプターのいずれかを使用してライブラリを作製しました。

データ
Twist Human Methylome Panel を 正規化前カバレッジ 150x で用いることで、オフベイト率の低い Picard 指標で均一なカバレッジを達成します。最小リード深度 10x で 659 万個の CpG サイトを検出しました。

Human Methylome Panel を用いたターゲットキャプチャにより、一つの Illumina Novaseq S4 フローセルで最大 82 サンプルの情報に富む CpG コールが実現します。一方、ターゲットエンリッチメントを行わない従来の全ゲノムバイサルファイトシーケンス（WGBS）では、同じフローセルで 3 サンプルしか処理できませんでした。Twist CpG メチル化特異的コントロールは、100% から 0% の範囲で計 8 種類のメチル化レベルを含む、48 種類の作為的配列で構成されています。これらのコントロールを含めることで、酵素変換プロセスの実験サンプルにおけるメチル化レベルを定量することができます。

結論
本研究では、さまざまな用途でゲノムワイドのメチル化パターンを調べるための、 Twist のメチル化検出製品群に含まれる新製品をいくつか使用しています。アッセイをよりよく制御するだけでなく、WGBS と比較してコストも削減できる方法について見いだすことができました。