Los GPCR están muy extendidos en la biología humana y participan en diversos procesos, como el metabolismo, la inflamación, la neurotransmisión y la carcinogénesis. La serie de bibliotecas de GPCR Twist aprovecha todas las interacciones conocidas entre GPCR y ligandos, y las diversidades de anticuerpos GPCR existentes para permitir el descubrimiento de anticuerpos más allá de las moléculas pequeñas dirigidas a GPCR existentes, lo que cubre solo el 13 % del GPCRoma humano. Esta serie de bibliotecas sintéticas completamente humanas incluye las bibliotecas GPCR 2.0 scFv, GPCR 3.0 scFv y VHH hShuffle GPCR.

Utilizando la plataforma de síntesis de ADN de alto rendimiento de Twist, se han construido múltiples bibliotecas de anticuerpos sintéticos de alta diversidad que sirven como poderosas herramientas para el descubrimiento de anticuerpos. Potenciando estas bibliotecas tan diversas, hemos podido identificar candidatos a anticuerpos de alta afinidad para una gran variedad de objetivos. Aquí demostramos el proceso de descubrimiento de anticuerpos para 6 citocinas o proteínas inmunomoduladoras objetivo. Este proceso abarca la construcción de bibliotecas de anticuerpos sintéticos, el uso de la visualización de fagos para cribar las bibliotecas en cuanto a proteínas objetivo biotiniladas y el cribado de los candidatos a guía mediante pruebas de unión ELISA y el rastreo de enriquecimiento por secuenciación de última generación (NGS). Utilizando un enfoque de alto rendimiento, los candidatos se reformatean en IgG o VHH-Fc de longitud completa; los anticuerpos monoclonales resultantes se validan a continuación mediante SPR y análisis celulares. Se identificaron muchos candidatos de alta afinidad con intervalos de unión de picomolar a nanomolar para los seis objetivos, lo que demuestra la eficacia de este proceso de descubrimiento.

Los anticuerpos deben unirse a sus objetivos con gran avidez para obtener resultados terapéuticos o de diagnóstico. El sistema inmunológico de los mamíferos puede producir anticuerpos con una afinidad de micro a nanomolar mediante la maduración por afinidad in vivo. Las tecnologías de visualización in vitro han superado este techo de afinidad y permiten descubrir anticuerpos con afinidades picomolares y femtomolares. Las tecnologías de visualización in vitro ofrecen un acceso inmediato a los genes de los fragmentos de anticuerpos, que posteriormente pueden polimerizarse para generar fusiones de anticuerpos de alta avidez. Entre los formatos de anticuerpos disponibles, los anticuerpos de dominio único (VHH) son unos de los más aptos para su ingeniería. Los anticuerpos VHH tienen muchas ventajas, como su mayor termoestabilidad, su menor peso molecular, su menor coste de producción y su formato modular para construir productos biológicos polivalentes. Estas ventajas han incitado a muchos a dar prioridad a los VHH a la hora de desarrollar anticuerpos diagnósticos y terapéuticos contra el coronavirus respiratorio agudo grave 2 (SARS-CoV- 2), el agente etiológico de la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Más recientemente, se han diseñado anticuerpos polivalentes contra el SARS-CoV-2. Los anticuerpos VHH pueden proceder de bibliotecas de anticuerpos inmunitarios, originales o sintéticos. Las bibliotecas inmunitarias y originales requieren la amplificación a partir de linfocitos B animales y son propensas a la redundancia y al sesgo, lo que puede limitar la diversidad de la biblioteca. Las bibliotecas sintéticas se basan en el diseño computacional in silico y utilizan oligonucleótidos sintéticos para introducir diversidad. Utilizando la exclusiva plataforma de síntesis de ADN basada en silicio de Twist, hemos generado bibliotecas de VHH con alta diversidad (>1010), precisión (1 error/2 kb) y productividad (>80 %). Recientemente, hemos notificado el descubrimiento de varios anticuerpos VHH-Fc de alta afinidad contra la subunidad de proteína S1 del SARS-CoV-2 a partir de estas bibliotecas. A diferencia de los métodos para la construcción de bibliotecas de anticuerpos sintéticos, los métodos para el cribado de polivalentes son comparativamente de bajo rendimiento e ineficaces para las construcciones polivalentes de orden superior, donde el número de permutaciones posibles aumenta exponencialmente. Comenzando con 13 candidatos VHH anti-S1, construimos bibliotecas polivalentes de VHH ensamblados en tándem, los cribamos mediante visualización de fagos y secuenciamos las bibliotecas enriquecidas para determinar las frecuencias posicionales de cada fragmento VHH individual. Utilizando esta línea de producción, diseñamos construcciones VHH-Fc polivalentes mono y biespecíficas con mayor afinidad por S1 que sus homólogos monovalentes.