cfDNA Pan-Cancer

Sobald diese Kontrolle in einer Library mit Indizes aufbereitet ist, gibt es keine Probleme beim Poolen dieser Kontrolle mit Patientenproben für die gleichzeitige Sequenzierung.

Alle 456 Varianten werden in einem Röhrchen gelagert.

Das Twist-Wildtyp-Hintergrund-cfDNA-Mimetikum stammt aus Zelllinien und wird mit unserer firmeneigenen Methode behandelt, um das Fragmentierungsprofil natürlich vorkommender cfDNA genau nachzuahmen, das durch einen scharfen mononukleosomalen Peak und einen sekundären dinukleosomalen Peak gekennzeichnet ist.

Twist hat eine Literaturrecherche durchgeführt, um zu einer Liste kuratierter, klinisch relevanter (d. h. umsetzbarer) krebsassoziierter Varianten zu gelangen, und nutzte außerdem die COSMIC-Datenbank als Referenz, in der passende Einträge verfügbar sind. Sie umfasst die vielen vorherrschenden Varianten bei soliden Tumoren bei Erwachsenen. Die 456 Varianten kommen in 85 spezifischen Genen vor. Außerdem versieht Twist separat den Satz klinisch relevanter Varianten (> 140 Varianten) mit Anmerkungen.

Die Konfiguration der Varianten sowie deren genaue Referenz- und Alternativ-Sequenz sind auf der Twist-Website aufgeführt.

Diese Deletion erfolgt im Gen ATM in einem genomischen Kontext mit 10 aufeinanderfolgenden Ts. Diese aufeinanderfolgenden Ts machen den Locus zu einer „rutschigen“ Sequenz, bei der die DNA-Polymerase, die eine Kopie des Genoms repliziert, dazu führen kann, dass der Matrizenstrang relativ zu dem zu synthetisierenden Strang verrutscht, was zu einer INSERTION/DELETION führt.

Es besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass derselbe Effekt durch denselben Mechanismus auftritt, wenn eine PCR-Polymerase die Sequenz während der Libraryvorbereitungs-PCR kopiert. Daher ist es besonders wahrscheinlich, dass dieser Locus aufgrund des PCR-Zyklus während der normalen Libraryvorbereitung spontan die Variantensequenz bildet.

Wenn das Allel überhaupt nicht vorhanden ist, weist jede menschliche Genomprobe (einschließlich des Pan-Cancer Reference Standard) aufgrund eines PCR-Fehlers einen erhöhten VAF für diese Mutation auf. (In pan-cancer 0% VAF, it shows up at a higher VAF than 99.8% of other variant sites in the standard.) Daher ist das Hintergrundrauschen aufgrund des genomischen Kontexts höher, was bedeutet, dass die Leerwertgrenze (Limit of Blank, LoB) dieser Variante aufgrund des Sequenzwettbewerbs wahrscheinlich höher ist als bei anderen Loci.

Wenn das Allel vorhanden ist, wird die wahre Allelfrequenz „zusätzlich“ zum Rauschpegel des Locus hinzugefügt, was bedeutet, dass diese Variante wahrscheinlich eine höhere Nachweisgrenze (Limit of Detection, LoD) aufweist als andere Variantenstellen.

Die Verwendung von UMI-Adaptern (wie den Twist UMI-Adaptern) und die Ausführung von Konsenskollaps und/oder Duplexkollaps können dazu beitragen, das Rauschen an diesem Locus aufgrund von PCR-Fehlern bei der Libraryvorbereitung zu verringern.

Der Standard enthält viele schwer zu erkennende Varianten, darunter Strukturvarianten und INSERTIONEN/DELETIONEN im Bereich von 1 bp bis 30 bp. Die Erkennung einzelner Varianten kann davon abhängen, welchen Aligner und welche Ausrichtungseinstellung der Kunde verwendet. Diese schwer zu erkennenden Varianten sind für erfahrene Kunden geeignet, die ihre Pipeline verwenden. Also ein Verständnis dafür haben. SNVs and small INDELs (e.g. 5 bp or smaller) are more straightforward for customers to detect.

Bei den Twist cfDNA-Kontrollen handelt es sich um doppelsträngige DNA. Sie sind eine Mischung aus synthetischen „ctDNA“-Molekülen, die mit der Twist-Technologie entworfen und gedruckt und in die Hintergrund-cfDNA gespikt wurden, um jeden spezifischen VAF-Spiegel zu bilden.

Twist führt eine komplette Exom-Sequenzierung für den Hintergrund-cfDNA-Hintergrund durch und nutzt ein Target-Capture auf dem 5 %-Material sowie eine ddPCR auf den Zwischen-VAFs.

Bei den Variantenfragmenten handelt es sich um doppelsträngige DNA-Moleküle mit stumpfen Enden.

Twist hat das Material als geeigneten Standard für nicht fragmentierende End-Repair- und A-Tail-Ligation(ERAT)-Libraryvorbereitungs-Protokolle sowie für Amplikonprotokolle wie ddPCR und qPCR getestet. Die Leistung des Pan-Cancer Reference Standard v2 ähnelt der von v1 und jedem anderen dsDNA-Input in die Libraryvorbereitung.

Twist führt Target-Enrichment-NGS auf der 0 % und 5 % VAF durch, um sicherzustellen, dass an allen Variantenstandorten keine bzw. eine Erkennung erfolgt. Darüber hinaus werden sechs Stellen über alle VAF-Werte hinweg mittels ddPCR bestätigt.

Zellfreie DNA wird in einem hochspezifischen biologischen Prozess erzeugt, der ein charakteristisches Fragmentlängenprofil ergibt. Daher empfehlen wir, eine Library vorzubereiten, die das Größenprofil in keiner Weise verändert: unter Verwendung des „Twist Mechanical Fragmentation Library Prep Kit“ ohne zusätzliche Fragmentierungsbehandlung. Unsere Library-Insertionsgrößen sehen hervorragend aus, wenn wir diese Methode anwenden. Wir haben Twist UMI-Adapter ausgiebig für die cfDNA-Proben verwendet; sie eignen sich hervorragend für Duplex-Konsens und gute Einschätzungen der Mutationsraten.

Das komplette Kit enthält 7 Stück. Wenn ein einzelnes Röhrchen 3 ug enthält, handelt es sich um ein einzelnes Röhrchen. Die Konfiguration mit 2 Röhrchen und 300 ng besteht aus 2 Röhrchen.

Twist empfiehlt, mit 30 ng Ausgangsinput zu beginnen. 20–30 ng ist ein typischer Bereich für einen Flüssigbiopsie-Assay.

Alle 456 Varianten werden durch NGS bestätigt (sowohl für 0 % als auch 5 % VAF), und die 0,1 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 % und 2 % werden aus einer Mischung aus 0 %- und 5 %-Material generiert. Wir haben einen Satz von sechs repräsentativen und relevanten Varianten über 0 % bis 5 % VAFs für ddPCR-Assays ausgewählt, die quantitative Formulierungen und eine kontinuierliche Reihenverdünnung zeigen.

Twist empfiehlt die Verwendung von „Low-EDTA TE“, d. h. 10 mM Tris pH-Wert 8, 0,1 mM EDTA. Wenn EDTA aus Gründen der Kompatibilität mit nachgelagerten Schritten vermieden werden muss, kann Qiagen Elution Buffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8) verwendet werden.

Die Twist-cfDNA stammt aus einer immortalisierten Zelllinie, die es uns ermöglicht, große Produktionschargen mit konsistenten Genotypen und Leistungen von Charge zu Charge zu erstellen.

Die Twist-Hintergrund-cfDNA wird mithilfe unseres firmeneigenen Fragmentierungsprozesses aus zuverlässiger nicht amplifizierter DNA gewonnen, und wir haben im Vergleich zum Konkurrenzmaterial eine extrem niedrige Mutationsrate beobachtet.

Sobald diese Kontrolle in einer Library mit Indizes aufbereitet ist, gibt es keine Probleme beim Poolen dieser Kontrolle mit Patientenproben für die gleichzeitige Sequenzierung.

Alle 456 Varianten werden in einem Röhrchen gelagert.

Das Twist-Wildtyp-Hintergrund-cfDNA-Mimetikum stammt aus Zelllinien und wird mit unserer firmeneigenen Methode behandelt, um das Fragmentierungsprofil natürlich vorkommender cfDNA genau nachzuahmen, das durch einen scharfen mononukleosomalen Peak und einen sekundären dinukleosomalen Peak gekennzeichnet ist.

Twist hat eine Literaturrecherche durchgeführt, um zu einer Liste kuratierter, klinisch relevanter (d. h. umsetzbarer) krebsassoziierter Varianten zu gelangen, und nutzte außerdem die COSMIC-Datenbank als Referenz, in der passende Einträge verfügbar sind. Sie umfasst die vielen vorherrschenden Varianten bei soliden Tumoren bei Erwachsenen. Die 456 Varianten kommen in 85 spezifischen Genen vor. Außerdem versieht Twist separat den Satz klinisch relevanter Varianten (> 140 Varianten) mit Anmerkungen.

Die Konfiguration der Varianten sowie deren genaue Referenz- und Alternativ-Sequenz sind auf der Twist-Website aufgeführt.

Diese Deletion erfolgt im Gen ATM in einem genomischen Kontext mit 10 aufeinanderfolgenden Ts. Diese aufeinanderfolgenden Ts machen den Locus zu einer „rutschigen“ Sequenz, bei der die DNA-Polymerase, die eine Kopie des Genoms repliziert, dazu führen kann, dass der Matrizenstrang relativ zu dem zu synthetisierenden Strang verrutscht, was zu einer INSERTION/DELETION führt.

Es besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass derselbe Effekt durch denselben Mechanismus auftritt, wenn eine PCR-Polymerase die Sequenz während der Libraryvorbereitungs-PCR kopiert. Daher ist es besonders wahrscheinlich, dass dieser Locus aufgrund des PCR-Zyklus während der normalen Libraryvorbereitung spontan die Variantensequenz bildet.

Wenn das Allel überhaupt nicht vorhanden ist, weist jede menschliche Genomprobe (einschließlich des Pan-Cancer Reference Standard) aufgrund eines PCR-Fehlers einen erhöhten VAF für diese Mutation auf. (In pan-cancer 0% VAF, it shows up at a higher VAF than 99.8% of other variant sites in the standard.) Daher ist das Hintergrundrauschen aufgrund des genomischen Kontexts höher, was bedeutet, dass die Leerwertgrenze (Limit of Blank, LoB) dieser Variante aufgrund des Sequenzwettbewerbs wahrscheinlich höher ist als bei anderen Loci.

Wenn das Allel vorhanden ist, wird die wahre Allelfrequenz „zusätzlich“ zum Rauschpegel des Locus hinzugefügt, was bedeutet, dass diese Variante wahrscheinlich eine höhere Nachweisgrenze (Limit of Detection, LoD) aufweist als andere Variantenstellen.

Die Verwendung von UMI-Adaptern (wie den Twist UMI-Adaptern) und die Ausführung von Konsenskollaps und/oder Duplexkollaps können dazu beitragen, das Rauschen an diesem Locus aufgrund von PCR-Fehlern bei der Libraryvorbereitung zu verringern.

Der Standard enthält viele schwer zu erkennende Varianten, darunter Strukturvarianten und INSERTIONEN/DELETIONEN im Bereich von 1 bp bis 30 bp. Die Erkennung einzelner Varianten kann davon abhängen, welchen Aligner und welche Ausrichtungseinstellung der Kunde verwendet. Diese schwer zu erkennenden Varianten sind für erfahrene Kunden geeignet, die ihre Pipeline verwenden. Also ein Verständnis dafür haben. SNVs and small INDELs (e.g. 5 bp or smaller) are more straightforward for customers to detect.

Bei den Twist cfDNA-Kontrollen handelt es sich um doppelsträngige DNA. Sie sind eine Mischung aus synthetischen „ctDNA“-Molekülen, die mit der Twist-Technologie entworfen und gedruckt und in die Hintergrund-cfDNA gespikt wurden, um jeden spezifischen VAF-Spiegel zu bilden.

Twist führt eine komplette Exom-Sequenzierung für den Hintergrund-cfDNA-Hintergrund durch und nutzt ein Target-Capture auf dem 5 %-Material sowie eine ddPCR auf den Zwischen-VAFs.

Bei den Variantenfragmenten handelt es sich um doppelsträngige DNA-Moleküle mit stumpfen Enden.

Twist hat das Material als geeigneten Standard für nicht fragmentierende End-Repair- und A-Tail-Ligation(ERAT)-Libraryvorbereitungs-Protokolle sowie für Amplikonprotokolle wie ddPCR und qPCR getestet. Die Leistung des Pan-Cancer Reference Standard v2 ähnelt der von v1 und jedem anderen dsDNA-Input in die Libraryvorbereitung.

Twist führt Target-Enrichment-NGS auf der 0 % und 5 % VAF durch, um sicherzustellen, dass an allen Variantenstandorten keine bzw. eine Erkennung erfolgt. Darüber hinaus werden sechs Stellen über alle VAF-Werte hinweg mittels ddPCR bestätigt.

Zellfreie DNA wird in einem hochspezifischen biologischen Prozess erzeugt, der ein charakteristisches Fragmentlängenprofil ergibt. Daher empfehlen wir, eine Library vorzubereiten, die das Größenprofil in keiner Weise verändert: unter Verwendung des „Twist Mechanical Fragmentation Library Prep Kit“ ohne zusätzliche Fragmentierungsbehandlung. Unsere Library-Insertionsgrößen sehen hervorragend aus, wenn wir diese Methode anwenden. Wir haben Twist UMI-Adapter ausgiebig für die cfDNA-Proben verwendet; sie eignen sich hervorragend für Duplex-Konsens und gute Einschätzungen der Mutationsraten.

Das komplette Kit enthält 7 Stück. Wenn ein einzelnes Röhrchen 3 ug enthält, handelt es sich um ein einzelnes Röhrchen. Die Konfiguration mit 2 Röhrchen und 300 ng besteht aus 2 Röhrchen.

Twist empfiehlt, mit 30 ng Ausgangsinput zu beginnen. 20–30 ng ist ein typischer Bereich für einen Flüssigbiopsie-Assay.

Alle 456 Varianten werden durch NGS bestätigt (sowohl für 0 % als auch 5 % VAF), und die 0,1 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 % und 2 % werden aus einer Mischung aus 0 %- und 5 %-Material generiert. Wir haben einen Satz von sechs repräsentativen und relevanten Varianten über 0 % bis 5 % VAFs für ddPCR-Assays ausgewählt, die quantitative Formulierungen und eine kontinuierliche Reihenverdünnung zeigen.

Twist empfiehlt die Verwendung von „Low-EDTA TE“, d. h. 10 mM Tris pH-Wert 8, 0,1 mM EDTA. Wenn EDTA aus Gründen der Kompatibilität mit nachgelagerten Schritten vermieden werden muss, kann Qiagen Elution Buffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8) verwendet werden.

Die Twist-cfDNA stammt aus einer immortalisierten Zelllinie, die es uns ermöglicht, große Produktionschargen mit konsistenten Genotypen und Leistungen von Charge zu Charge zu erstellen.

Die Twist-Hintergrund-cfDNA wird mithilfe unseres firmeneigenen Fragmentierungsprozesses aus zuverlässiger nicht amplifizierter DNA gewonnen, und wir haben im Vergleich zum Konkurrenzmaterial eine extrem niedrige Mutationsrate beobachtet.