このワークショップでは、ヒトにおけるエピジェネティックな変化について研究する研究者に、最適化された Twist のメチル化シーケンスソリューションからどのような恩恵を受けているかお話を伺いました。彼女らがどのようにワークフローを設計・最適化したのか、疾患の予測因子としてエピジェネティックな変化をどのように探求しているのか、そしてそうした研究のためになぜ Twist のソリューションを選んだのかについてご覧ください。

微小／分子残存病変（MRD）とは、治療介入後に患者の体内に残存するわずかな数の腫瘍細胞のことです。そうした残存腫瘍細胞を検出し、その量をモニタリングすることは、再発の危険性がある人や術後補助療法が必要な人を特定する有望な予後マーカーとなります。寛解期に採取された検体には ctDNA が少ないため、MRD アッセイは高感度である必要があります。加えて、人によって異なる体細胞変異が存在するため、検出には個別化ソリューションが必要となります。そのため、MRD の診断には、高い感度と特異性を備えた個別化 NGSアッセイが求められています。このニーズに対応し、MRD についての正確な評価を可能にするために、 Twist Bioscience は MRD Rapid 500 Panels を開発しました。この製品を用いることで、完全に個別化した MRD パネル（最大 500 ターゲット）を最短６日で設計、製造、出荷することが可能です。Twist Rapid 500 MRD パネルの検出感度を実証するため、胸、肺、大腸がん（CRC）、メラノーマ、腎細胞がんに見られる体細胞突然変異を特異的に標的とする５種類のカスタム MRD パネルを設計しました。これらの MRD パネルはそれぞれ、各組織あたり３～５つの変異、選定された一連のパッセンジャー変異を含む 197 のターゲットを含むように設計されました。各パネルのプローブ配列は、テストサンプルセットのバリアントアレルを組み込むように設計されました。サンプルセットを作成するために、合成バリアント配列と断片化した細胞株gDNA（NA12878）をブレンドし、プロファイルの無細胞および循環腫瘍DNAに近似した作為的な検体を形成しました。平均変異アレル頻度（VAF）を 0%（WT）、0.01%、0.05%、0.1%、2%とする５段階の頻度レベルを用意しました。Libraries were prepared with UMI adapters and target enrichment was performed using the MRD panels.    With a sequencing depth of 80,000x, variant calling results revealed that an average of 20 SNV targets can be detected with confidence in the 0.01% VAF samples for each MRD panel, clearly distinguishable from the WT control samples. 変異アレルをターゲットとしたバリアントコールの精度が実証されただけでなく、非常に低いレベル（例えば 0.01% VAF）の MRD シグネチャーの検出のために多数の変異をターゲットとすることの有用性が示されています。以上をまとめると、 Twist MRD Rapid 500 Panels はそのパフォーマンスにより、超低頻度の体細胞突然変異を高感度で検出できることが示されました。

Introduction DNA methylation at CpG nucleotide sites in eukaryotes is a key epigenetic mark that helps regulate gene expression. CpG メチル化において、特定の変化がヒトの多くの種類のがんで生じており、がんを早期に検出するための有望なバイオマーカーとなっています。しかし、既存のアッセイはコストが高く、関心領域に対する特異性に欠ける場合があり、メチル化分画の半定量的な推定値しか得られないこともあります。本ポスターでは、 NGS 関連コストを削減するためのターゲット・メチロームパネルの使用、定量アッセイの較正に用いるメチル化コントロール、低多様性サンプルにおける正確な重複排除のための UMI など、そうした課題に対処するための新しいツールをご紹介します。Experimental Procedures Genomic DNA (gDNA) was prepared for sequencing using the Twist Methylation Detection System consisting of enzymatic methyl conversion library generation and hybrid capture using the Twist Human Methylome Panel. CpG メチル化の検出に使用できる Twist の特定のコントロールを、検出アッセイの較正にどのように用いることができるかを示すために、ライブラリ調製前にそれらのコントロールをさまざまなメチル化率を持つ gDNA にスパイクインし、 Twist NGSメチル化検出システムで相同パネルを用いて処理しました。さらに、定量的検出と全ユニークカバレッジへの影響を調べるために、ライブラリ調製におけるライゲーションステップでセルフリー DNA (cfDNA) および従来のアダプターまたは UMI を含むアダプターのいずれかを使用してライブラリを作製しました。Data Using the Twist Human Methylome Panel at 150x raw coverage achieves uniform coverage with low off-bait Picard metrics. 最小リード深度 10x で 659 万個の CpG サイトを検出しました。Human Methylome Panel を用いたターゲットキャプチャにより、一つの Illumina Novaseq S4 フローセルで最大 82 サンプルの情報に富む CpG コールが実現します。一方、ターゲットエンリッチメントを行わない従来の全ゲノムバイサルファイトシーケンス（WGBS）では、同じフローセルで 3 サンプルしか処理できませんでした。Twist CpG メチル化特異的コントロールは、100% から 0% の範囲で計 8 種類のメチル化レベルを含む、48 種類の作為的配列で構成されています。これらのコントロールを含めることで、酵素変換プロセスの実験サンプルにおけるメチル化レベルを定量することができます。Conclusions Our study uses several new products found in the Twist methylation detection portfolio that interrogate genome-wide methylation patterns for various applications. アッセイをよりよく制御するだけでなく、WGBS と比較してコストも削減できる方法について見いだすことができました。